刺参(Apostichopus japonicus Selenka)养殖池塘生态系统微生物结构与功能研究

摘要

刺参（Apostichopus japonicus Selenka）养殖业是我国特色海水养殖产业之一，主要分布在辽宁和山东沿海。刺参养殖业发展迅速，2010年全国刺参养殖面积已达到16万公顷，产量达13万吨，产值接近200亿元。然而，相对于其迅速发展的规模，与刺参养殖技术相关的基础研究还比较滞后。目前，在刺参的养殖生产实践中，微生物修复技术已越来越受到人们的重视。微生物修复作用的强弱与养殖环境中微生物群落的生态结构与功能特征密切相关，反之，微生物群落的生态结构与功能特征能够反映环境的健康状况。因此，了解刺参养殖池塘环境微生物群落的结构和功能特征具有十分重要的意义。
　　本研究采用PCR-DGGE指纹图谱技术和BIOLOG-ECO微平板培养法，研究了刺参养殖池塘水体、底泥和附着基沉积物中的微生物群落结构和功能以及它们与环境因子间的相互关系；另外，对几株前期分离筛选自刺参池塘环境中的潜在益生菌进行了饲喂刺参实验以探讨它们对刺参生长和免疫提高方面的功能作用。本研究旨在为刺参池塘环境微生态调控模式的建立提供基础资料。主要研究结果如下：
　　1.刺参池塘环境微生物群落结构的季节变化
　　利用 PCR-DGGE技术和冗余分析（RDA）方法研究了刺参（Apostichopus japonicus）养殖池塘环境（水体、底泥、附着基）细菌微生物群落结构的季节变化及其与环境因子间的关系。结果表明：（1）刺参养殖水体中的优势菌群归属于a-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、Bacteroidetes、Cyanobacteria及一部分未知不可培养菌群（uncultured bacteria）。变形菌纲细菌（Proteobacteria）为各季节水体中的绝对优势菌群，其相对丰度在49.3-72.1％之间，其中以a-Proteobacteria含量最高；Cyanobacteria仅出现在秋季水体中，其丰度颇低。显著性方差分析结果发现，γ-Proteobacteria菌群丰度具有显著的季节变化。比较而言，水体细菌群落结构以秋季最复杂，冬季最简单。（2）底泥中的优势菌群归属于a-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、δ-Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflex、Actinobacteria和 Sphingobacteria。变形菌纲细菌为各季节底泥中的绝对优势菌群，其相对丰度在49.6-55.1%之间，其中又以γ-Proteobacteria含量占绝对优势；Chloroflex菌群仅出现在春、秋季节样品中，且春季丰度较高；Actinobacteria菌群在春季样品中未检测到。显著性方差分析发现，Actinobacteria菌群丰度在夏季显著高于冬季。比较而言，底泥细菌群落结构以秋季最复杂。（3）附着基中的优势菌群归属于a-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、δ-Proteobacteria、ε-Proteobacteria、Flavobacteria、Bacteroidetes、Cyanobacteria、Actinobacteria及uncultured bacteria。变形菌纲为各季节附着基中的绝对优势菌群，其相对丰度在54.6-60.2%之间，其中以a-Proteobacteria、γ-Proteobacteria含量最高；Flavobacteria相对丰度亦颇高，其中在春、夏季节含量仅次于a-Proteobacteria；Cyanobacteria在春季样品中未检测到，Actinobacteria在夏季样品中未检测到。显著性分析结果表明，γ-Proteobacteria、ε-Proteobacteria和Flavobacteria3类菌群含量具有显著季节变化。附着基细菌群落结构在秋、冬季较春、夏季复杂。（4）RDA分析发现，T、TN、NO3-N、PO4-P和NO2-N是影响水体细菌群落结构季节变化的主要环境因子，PO4-P、NH4-N、NO3-N和TP是影响底泥细菌群落结构季节变化的主要环境因子，TP、TN、TOC、SOM和 NO3-N是影响附着基细菌群落结构季节变化的主要环境因子。本研究结论认为，刺参池塘水体、底泥和附着基细菌群落结构具有明显的不同的季节变化，相对而言，底泥菌群结构较水体和附着基稳定；水体、底泥和附着基菌群结构组成存在明显差异，其中以附着基菌群结构最复杂，生物多样性最丰富，水体中最简单；刺参池塘水体、底泥和附着基细菌群落结构季节变化与环境因子具有很好的相关性。
　　2.刺参池塘环境微生物群落功能多样性的季节变化
　　利用BIOLOG技术和冗余分析（RDA）方法对刺参（Apostichopus japonicus）养殖池塘环境（水体、底泥、附着基）微生物群落功能多样性的季节变化及其与环境因子间的关系进行了研究。结果表明：（1）刺参池塘水体、底泥和附着基微生物对碳源总量和单类碳源的利用均具有显著的季节变化，总体表现为春、夏、秋季节高于冬季，其中水体微生物利用比例较高的碳源类型为聚合物，底泥微生物利用比例较高的碳源类型为聚合物、糖类、羧酸和氨基酸，附着基微生物利用比例较高的碳源类型为聚合物、糖类、氨基酸和胺。（2）主成分分析表明，刺参池塘水体、底泥和附着基微生物碳代谢方式均具有显著的季节变化。水体中，与主成分显著相关的碳源有15种，其中与主成分1显著相关的碳源主要有10种，分别属于聚合物、糖类、羧酸、氨基酸和胺；底泥中，与主成分显著相关的碳源有18种，其中与主成分1显著相关的主要有13种，分别属于糖类、羧酸和氨基酸；附着基中，与主成分显著相关的碳源有22种，其中与主成分1显著相关的主要有20种，分别属于聚合物、糖类、羧酸和氨基酸。（3）刺参池塘水体、底泥和附着基微生物多样性指数Shannon、McIntosh、Simpson和S-E均匀度均存在显著的季节变化，但不同指数之间的变化有较大差异。（4）RDA分析表明，TP、NO3-N、TN和PO4-P是影响刺参池塘水体微生物群落功能多样性季节变化的主要因素；TP、NO3-N和 PO4-P是影响底泥微生物功能多样性季节变化的主要因素；SOM、NO3-N和TN是影响附着基微生物功能多样性季节变化的主要因素。结论认为，刺参池塘水体、底泥和附着基微生物功能多样性具有显著的不同的季节变化，这些变化与环境因子具有很好的相关性。
　　3.刺参池塘不同类型附着基微生物群落结构研究
　　利用 PCR-DGGE技术和冗余分析（RDA）方法研究了刺参（Apostichopus japonicus）养殖池塘不同类型附着基（瓦片、网笼、塑料管）细菌微生物群落结构特征及其与环境因子间的关系。结果表明：（1）瓦片与网笼附着基中的优势菌群群落组成相同，均归属于a-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、Sphingobacteria、Chloroflex、Bacteroidetes、Cyanobacteria、Flavobacteria；而塑料管附着基中的优势菌群归属于a-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、Sphingobacteria、Chloroflex、Bacteroidetes、Actinobacteria、Flavobacteria。（2）黄杆菌纲细菌（Flavobacteria）为各附着基样品中的绝对优势菌群，其相对丰度均在45%以上，但在不同类型附着基之间无显著差异。变形菌纲（Proteobacteria）为各附着基中的第二大优势菌群，其相对丰度在瓦片中最低（20.7%），网笼中最高（34.7%），其中瓦片和塑料管中以γ-Proteobacteria占优势，网笼中以a-Proteobacteria占优势；显著性方差分析表明，变形菌纲相对丰度在不同类型附着基中具有显著差异，其中a-Proteobacteria在网笼中丰度（16.2%）显著高于瓦片（9.5%）和塑料管（6.4%），γ-Proteobacteria在塑料管中丰度（28.3%）显著高于瓦片（11.2%）和网笼（13.2%）。拟杆菌纲（Bacteroidetes）相对丰度在瓦片、网笼和塑料管中依次降低，其在瓦片中的含量（6.0%）显著高于塑料管（0.4%）；蓝藻纲（Cyanobacteria）细菌丰度（在塑料管中未检测到）在各附着基中的变化趋势与拟杆菌纲相同。Actinobacteria仅出现在塑料管附着基样品中。Sphingobacteria和Chloroflex相对丰度在不同附着基之间无显著差异。（3）RDA分析发现，TN、PO4-P、NO3-N和 NH4-N是不同类型附着基细菌群落结构差异的主要影响环境因子。本研究结论认为，刺参池塘瓦片、网笼和塑料管附着基细菌群落结构不同，比较而言，瓦片和网笼附着基细菌群落结构特征最相似，而塑料管附着基中的菌群结构与瓦片和网笼中差异较大；刺参池塘瓦片、网笼和塑料管附着基细菌群落结构特征与环境因子具有很好的相关性。
　　4.刺参池塘不同类型附着基微生物群落功能多样性研究
　　利用BIOLOG技术和冗余分析（RDA）方法对刺参（Apostichopus japonicus）养殖池塘不同类型附着基（瓦片、网笼、塑料管）微生物群落功能多样性及其与环境因子间的关系进行了研究。结果表明：（1）瓦片、网笼和塑料管附着基微生物对碳源总量和单类碳源的利用均具有明显差异，总体表现为塑料管>网笼>瓦片，其中塑料管和网笼附着基微生物对单类碳源的代谢强度均显著高于瓦片；塑料管附着基微生物利用比例较高的碳源类型为聚合物、糖类和氨基酸，网笼附着基微生物利用比例较高的碳源类型为聚合物、糖类和羧酸，瓦片附着基微生物利用比例较高的碳源类型为聚合物和羧酸。（2）主成分分析表明，瓦片、网笼和塑料管附着基微生物碳代谢方式均具有显著差异，这种差异主要体现在主成分1上；与主成分1显著相关的碳源有13种，分别属于聚合物（3种）、糖类（4种）、氨基酸（4种）、羧酸（1种）和胺（1种）。（3）瓦片、网笼和塑料管附着基微生物碳代谢多样性指数McIntosh和Simpson均存在显著差异，其中McIntosh指数在网笼和塑料管中显著高于瓦片，Simpson指数在塑料管中显著高于瓦片；而Shannon和S-E均匀度均无显著差异。（4）RDA分析表明，TN、PO4-P和NO3-N是不同类型附着基微生物功能多样性差异的主要影响环境因子。结论认为，刺参池塘瓦片、网笼和塑料管不同类型附着基微生物功能多样性具有显著的不同，这些差异与环境因子具有很好的相关性。
　　5.饲料中添加潜在益生菌对刺参生长和非特异性免疫酶活性的影响
　　研究了饲喂1株马氏副球菌（Paracoccus marccui DB11）和1株芽孢杆菌（Bacillus baekryungensis YD13）对刺参（Apostichopus japonicus）生长和非特异性免疫酶活性的影响。将DB11或YD13分别以3个添加浓度水平（1×104、1×106和1×108 cfu/g）添加于基础饲料中饲喂刺参（初始体质量（5.34±0.11）g）60d（以基础饲料饲喂组为对照），试验它们对刺参生长和刺参不同体组织中非特异性免疫酶活性的影响。生长实验结果表明：与对照相比，饲料中添加1×108 cfu/g DB11、1×104或1×106 cfu/g YD13功能。

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引言

第一部分（章） 文献综述

1.1 微生物生态及其与水产养殖的关系

1.2 刺参养殖业现状及主要存在问题

1.3 本论文的立题依据和主要研究内容

第二部分 刺参养殖池塘生态系统微生物群落结构与功能多样性的季节变化

第二章 刺参池塘环境微生物群落结构的季节变化

第三章 刺参池塘环境微生物群落功能多样性的季节变化

第三部分 刺参池塘不同类型附着基微生物群落结构与功能多样性研究

第四章 刺参池塘不同类型附着基微生物群落结构研究

第五章 刺参池塘不同类型附着基微生物群落功能多样性研究

第四部分 饲料中添加潜在益生菌对刺参生长和非特异性免疫酶活性影响研究

第六章 饲料中添加潜在益生菌对刺参生长和非特异性免疫酶活性的影响

参考文献

致谢

个人简历

博士期间完成学术论文