中国对虾基因组DNA甲基化MSAP技术的建立与应用

摘要

本文建立并优化了中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)基因组 DNA甲基化敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP)技术，从表观遗传学角度分析讨论了中国对虾野生群体和人工选育种黄海1号不同组织间的甲基化水平和多态性差异，分析了在氨氮和 pH胁迫条件下中国对虾基因组DNA的甲基化模式，探讨了甲基化修饰是否参与中国对虾抗逆性状的分子机制，以期为中国对虾抗氨氮和pH新品种培育提供理论依据。主要研究内容分为以下三个部分：
　　第一部分建立并优化了中国对虾DNA甲基化分析的MSAP程序和体系。主要从酶切体系、预扩增 PCR体系和选择性扩增体系三个方面进行。包括内切酶量、酶切时间、模板浓度、预扩增缓冲液量以及聚丙烯酰胺凝胶浓度等条件的优化，获得最佳反应程序和体系。酶切反应：7.5U同裂酶HpaII或MspI，EcoRI对1uL DNA模板37℃酶切8h；预扩增反应：10倍稀释连接产物为模板，1U Taq DNA Polymerse，2.2 uL10×Taq buffer(Mg2+=33pmol)共20体系；选择性扩增反应：10倍稀释预扩增产物为模板，30pmol引物，1U Taq DNA Polymerse，2.0 uL10×Polymerse buffer。选扩增产物经变性在6％聚丙烯酰胺凝胶电泳下进行MSAP分析。
　　第二部分应用建立的MSAP技术分别对中国对虾野生群体和选育品种―黄海1号‖的肌肉、鳃、血液三种组织基因组DNA的CCGG甲基化水平进行对比分析，试图从表观遗传学角度探讨影响中国对虾生长性状的分子机制。采用30对引物进行选择性扩增，结果显示：中国对虾野生群体肌肉、鳃和血液的甲基化比例分别为23.1%、22.3%和19.7%；黄海1号肌肉、鳃和血液的甲基化比例分别为21.4%、19.6%和18.9%。中国对虾野生群体和―黄海1号‖同一组织间的甲基化水平不同（P≤0.05），而肌肉、鳃和血液不同组织间的甲基化水平也各不相同（P≤0.05）。DNA甲基化多态性分析结果表明：中国对虾野生群体和―黄海1号‖各组织的多态性条带转变中，鳃组织的多态性变化幅度最大，Class d、Class c、Class b中 typeⅠ均发生增高或降低；肌肉其次，只在Class b中typeⅠ升高54.2%；而血液最为稳定，无明显变化。
　　第三部分应用MSAP技术对不同浓度氨氮和不同pH梯度急性胁迫处理的中国对虾肌肉组织进行基因组DNA甲基化模式分析，以期为中国对虾抗氨氮和抗pH品系的选育提供理论依据。氨氮胁迫试验结果表明：中国对虾DNA甲基化水平变化在23.66%-24.17%，当NH4Cl≤8mg/L时，中国对虾DNA总甲基化水平下降，但与对照组相比，差异不显著（P≧0.05），而半甲基化水平则发生明显上升（P≤0.05）。当NH4Cl≥8mg/L，DNA总甲基化水平上升，其上升趋势与氨氮浓度呈一定的正相关性。pH胁迫试验结果表明：中国对虾 DNA甲基化水平变化的幅度为21.73%-22.11%，pH值小于8.0或大于8.8急性胁迫时，DNA总甲基化水平降低，前者降低幅度（pH7.2和7.6时分别降低0.34%和0.38%；）与后者（pH=8.8和9.2时分别降低0.21%和0.28%）相比差异显著（P≤0.01）。而半甲基化水平反应趋势则随pH的增加而降低。

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第一章 文献综述

1 表观遗传学

2 DNA甲基化

3 MSAP的应用原理及研究现状3.1 MSAP方法的应用原理

第二章 中国对虾MSAP体系的建立与优化

1 材料与方法

2 实验结果与分析

3 讨论

第三章 中国对虾野生群体和黄海 1 号不同组织基因组DNA甲基化的MSAP分析

1 材料与方法

2 结果与分析2.1 MSAP带型分析

3讨论

第四部分 氨氮和pH胁迫下中国对虾基因组DNA甲基化的MSAP分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3讨论

参考文献

致谢

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