表面展示甲基对硫磷水解酶的解脂耶罗威亚酵母工程菌的构建及全细胞酶固定化研究

摘要

本文利用表面展示质粒 pINA1317-YICPW110将来源于假单胞菌(Pseudomonas sp.)WBC-3的甲基对硫磷水解酶(methyl parathion hydrolase, MPH)展示在解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)Po1h细胞表面，研究了重组工程菌的催化特性和降解性能。该工程菌安全无害、不携带抗性基因、目的基因表达无需诱导且可稳定遗传，而且避免了采用非表面展示重组工程菌进行甲基对硫磷降解时需要破碎细胞、酶纯化时活性降低、酶与底物接触不充分等问题；为进一步提高全细胞酶的重复使用性和连续操作的稳定性，通过将绿色木霉(Trichoderma Viride)内切葡聚糖酶IV(EG IV)的纤维素结合域(cellulose binding domain, CBD)与甲基对硫磷水解酶的融合蛋白展示在Y. lipolytica Po1h细胞表面，构建了可特异吸附于纤维素基质上的全细胞甲基对硫磷水解酶，采用固定化全细胞酶对甲基对硫磷进行降解研究，解决了甲基对硫磷水解酶采用常规固定化方法出现的活力下降、操作繁琐、费用昂贵等问题。本文构建了一种操作简便、稳定高效、安全无害的固定化全细胞甲基对硫磷水解酶，开辟了国内甲基对硫磷降解的新思路和新手段，为甲基对硫磷降解提供了理论依据和技术支撑。主要研究结果如下：
　　(1)利用表面展示质粒pINA1317-YlCWP110将Pseudomonas sp.WBC-3的甲基对硫磷水解酶在Y. lipolytica Po1h上进行了表面展示，通过免疫荧光检测和蛋白酶敏感性分析确定甲基对硫磷水解酶已成功展示于Y. lipolytica Po1h细胞表面。筛选得到甲基对硫磷水解酶酶活力最高的转化子Z51，其甲基对硫磷水解酶比酶活力为36.5±0.5 U/mg cells(450.6±7.3 U/mL cell suspension)，酶活力优于已有的多种重组表达的甲基对硫磷水解酶活力。
　　(2)表面展示甲基对硫磷水解酶的最适作用pH为9.5，在pH4.0-11.5之间较稳定；最适作用温度为40℃，在40℃以下稳定性较好。Co2+、Mn2+、Ni2+、Cu2+对表面展示甲基对硫磷水解酶活性有激活作用，Ag+、Li+、Ba2+、Hg2+对展示酶活力有抑制作用，K+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Na+对展示酶活力没有明显的影响。在10.0mL反应体中的最佳水解条件为100mg/L甲基对硫磷、2.6×107 cells/ml表面展示甲基对硫磷水解酶的酵母细胞、反应时间30 min，甲基对硫磷水解率可达90.8％。全细胞酶终浓度为2×107 cells/ml、甲基对硫磷浓度为20.0 mg/L的不同水体40℃、180 rpm振荡反应40 min，甲基对硫磷的降解率依次为淡水(pH9.5)98.7%、淡水(pH6.8)97.0%、海水(pH9.5)96.5%和海水(pH8.2)94.4%，全细胞酶重复使用4次后，仍可保持70%以上的活力。全细胞酶在4℃放置30天，仍能保持94%的活性。
　　(3)采用重叠延伸PCR技术，构建绿色木霉EG IV的CBD和Pseudomonas sp.WBC-3 MPH的融合基因片段，利用表面展示质粒pINA1317-YlCWP110将MPH-CBD融合蛋白在Y. lipolytica Po1h酵母上进行了表面展示，通过免疫荧光检测和蛋白酶敏感性分析确定MPH-CBD融合蛋白已成功展示于Y. lipolytica Po1h细胞表面。筛选得到甲基对硫磷水解酶酶活力最高的转化子M3，其甲基对硫磷水解酶比酶活力为33.1±1.1 U/mg cells(381.0±9.2 U/mL cell suspension)，甲基对硫磷水解酶的活性基本未受到CBD的影响。
　　(4)表面展示MPH-CBD融合蛋白的转化子M3细胞吸附纤维素基质的最适pH为8.0，最适温度为4℃，在4℃-40℃之间具有良好的吸附性。M3细胞通过表面展示的MPH-CBD融合蛋白对纤维素基质具有较高的吸附能力，且细胞与纤维素基质的的结合非常牢固。将M3细胞固定于微晶纤维素上，制成固定化全细胞酶。填充有固定化全细胞酶的柱式生物反应器于流速为120 ml/h、pH为9.5、温度为室温25℃时，对26.0 mg/L甲基对硫磷的降解率在10 min时即可达到80%以上。在随后的60 min内，甲基对硫磷的降解率一直保持在80%左右。反应器在30天内对26.0 mg/L的甲基对硫磷可保持约77%的降解率。

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0 前 言

1 有机磷农药生物降解的研究进展

1.1 有机磷农药的污染和危害

1.2 有机磷农药的微生物降解

1.3 有机磷水解酶的表面展示

1.4 表面展示有机磷水解酶的工程菌的固定化

1.5 研究目的和技术路线

2 假单胞菌WBC-3甲基对硫磷水解酶在解脂耶罗威亚酵母上的表面展示

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

2.5 小结

3 表面展示甲基对硫磷水解酶酶学性质和全细胞酶降解甲基对硫磷的研究

3.1材料

3.2 方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5小结

4 假单胞菌WBC-3甲基对硫磷水解酶与绿色木霉内切葡聚糖酶IV纤维素结合域的融合蛋白在解脂耶罗威亚酵母上的表面展示

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 小结

5表面展示MPH-CBD融合蛋白的解脂耶罗威亚酵母的固定化及甲基对硫磷的降解研究

5.1材料

5.2方法

5.3结果与分析

5.4讨论

5.5小结

6结论与创新点

6.1结论

6.2创新点

参考文献

个人简历及发表的学术论文

致谢