基于DNA条形码技术的山东半岛潮间带褐藻和绿藻分类研究

摘要

生物分类和演化的研究向来是人们关注的科学问题,准确的分类鉴定不仅是分类学家一直追求的目标,也是开展其他科学研究的重要前提。经典分类主要依据形态学的方法。形态鉴定容易受很多因素的影响,例如物种性别和发育阶段,一些物种在不同性别个体和不同发育阶段,它们的形态产生差别。随着分子生物学的发展和测序技术的成熟,用一段特征的DNA条形码技术作为鉴定物种的手段受到越来越多学者的关注。本论文以从山东半岛采集的褐藻和绿藻为样品,利用形态学方法和DNA条形码技术对褐藻门和绿藻门进行了物种分类鉴定,同时对各门所使用的基因进行评价,以及分别分析了褐藻门和绿藻门系统进化关系。
　　自2012年3月到2013年10月,在山东半岛采集褐藻物种共81株样品。经形态鉴定共鉴定出20不同的物种,分属9目12科16属。部分样品通过形态只能鉴定到某目或科或属。经过DNA条形码鉴定有61株被鉴定为15种不同的物种,分属于10目,13科,14属,有20株被鉴定到4个不同的属中。DNA条形码方法结合形态共鉴定出24种不同物种,分属于10目,13科,17属。对扩增褐藻的COI、ITS和LSU基因评估,结果发现COI的扩增效率高于其他两个基因,在鉴定能力方面,COI基因适合鉴定种水平的物种。LSU基因适合鉴定属或属以上水平的物种鉴定,由于单一基因无法完全鉴定出褐藻门物种,我们推荐将COI和LSU基因组合起来鉴定物种。而ITS基因虽然对区分相似物种能力同COI基因相似,但是该基因在扩增过程中较难获得单一完整的序列,而且序列替换饱和不适合构建系统发育树,因此我们不推荐使用ITS基因用于褐藻门这个大范围的物种鉴定。此外,我们还对褐藻门内各目系统进化关系做了分析,分析褐藻门各目进化关系,水云目和萱藻目进化关系较近,其次与海带目进化关系较近。网地藻目网地藻目代表独立进化支系,和褐藻的其他的目亲缘关系较远。
　　我们从山东半岛和福建莆田地区共采集了125株绿藻样品,时间分别从2012年3月到2013年10月。经形态鉴定,有113株样品鉴定到27种,分属于5目7科8属。还有部分样品只能鉴定到目或科或属。DNA条形码方法结合形态共鉴定出通过分子鉴定结合形态共鉴定出29个物种,分属于6目8科13属。绿藻门样品除刚毛藻科样品外用ITS、rbcL和tufA三个基因进行扩增和测序,结果发现tufA基因能够成功扩增96％除刚毛藻科之外的绿藻样品,并且能够很好的区分相近物种;rbcL基因的区分近缘物种的能力同tufA基因能力相似,但是其扩增效率比tufA基因低;ITS基因与其他两个基因相比扩增效率明显偏低,在区分物种能力方面,该基因DNA barcoding gap值与其他两个基因的值都小,而且明显不能区分开―LPP‖(Ulva linza、Ulva procera和Ulva prolifera)簇群。选择ITS、18S rDNA和LSU基因扩增刚毛藻科样品,三个基因的扩增效率和测序效率均比较高。ITS对不同物种区分能力强;LSU基本能区分不同物种,但能力比ITS弱;而18S rDNA适合对属水平或科水平的物种鉴定。通过构建系统进化树发现,我们研究结果同国内的分类体系有差别,支持国际上绿藻门分类体系,我们建议石莼属和浒苔属归为石莼属,石莼目的盒管藻科、礁膜藻科和顶管藻目的顶管藻科划分到丝藻目中,松藻目降为松藻科归到羽藻目中。
　　龙须菜是一种重要的经济海藻,在我国有大规模的养殖。2012年12月到2013年11月(除2013年6、7、8月)从福建莆田南日岛龙须菜养殖场采集附着有某种仙菜的龙须菜。首先通过采集每个月份龙须菜上的附生藻所占的百分比来研究附生藻对龙须菜生长的影响。该附生藻对龙须菜生长的影响夏秋季节附生严重,冬天和初春附生的影响不大,表明温度是造成附生的重要条件。通过表观和冷冻切片观察,该附生仙菜的附着方式是附生藻通过类似假根的组织渗入到龙须菜皮层中,这种附着方式是对宿主龙须菜的损伤是最严重的。根据附生仙菜形态特征,判断该附生藻属于仙菜属,不能确定到种。分子鉴定通过扩增该物种的 rbcL基因发现,它与Ceramium filicula的遗传距离仅为0.9%,在构建的系统进化树中该物种与Ceramium filicula聚为一支并且节点处自检值为100。所以我们将这种附生仙菜初步鉴定为Ceramium filicula。Ceramium filicula在中国是首次报道,我们推测可能是隐藏种或是一种新型的入侵海藻。

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前言

1 DNA 条形码技术的形成和发展

2 DNA条形码技术的定义、方法和目标

3 国际上、我国的DNA 条形码技术研究进展

4 DNA 条形码技术应用

5 DNA条形码技术的优势及局限性

6 DNA条形码技术的发展前景及展望

第一章 山东半岛潮间带褐藻的分类研究

前言

第一节 山东半岛潮间带褐藻门的形态鉴定

第二节山东半岛潮间带褐藻的DNA条形码鉴定

第二章 山东半岛潮间带绿藻门分类研究

前言

第一节 山东半岛潮间带绿藻门的形态鉴定

第二节 山东半岛潮间带绿藻门的DNA条形码鉴定

第三章 一株栽培龙须菜上附生仙菜研究

前言

第一节 附生仙菜对养殖龙须菜生长影响及其附生方式研究

第二节 栽培龙须菜附生仙菜的形态鉴定及DNA条形码鉴定

参考文献

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