腐败希瓦氏菌噬菌体Spp001基因序列及其裂解活性研究

摘要

腐败希瓦氏菌被认定为冷藏鲜鱼的特定优势腐败菌,是导致鱼制品的腐败重要因素,因此通过控制腐败希瓦氏菌生长可以延长鱼类食品货架期。内溶素是噬菌体繁殖后期释放子代过程中编码的一类蛋白,能够水解宿主菌细胞壁。内溶素因其高效裂解宿主菌和专一性作用宿主菌已经应用到各个领域中,包括食品保藏。目前传统的保鲜方法中还没有既能专门作用特定腐败菌又能保持产品品质的方法。内溶素有望作为新型生物保鲜剂用于防止细菌感染和控制细菌的生长。
　　前期工作已经证明,噬菌体Spp001用于冷藏牙鲆鱼肉的防腐中可以有效延长鱼类货架期并表现出其应用潜力。为了更深入的认识与噬菌体Spp001裂解性能,本研究在基因水平上,通过对噬菌体Spp001全序列分析,寻找与裂解有关的蛋白,推测其裂解机制,并且建立了共沉法提取含有内溶素的粗酶液的方法及相应的检测方法,分析并验证其裂解活性,测定其酶学性质。
　　本文首次报道了一株新型腐败希瓦氏菌噬菌体Spp001全序列基因信息,噬菌体Spp001的宿主菌为腐败希瓦氏菌Sp225。噬菌体Spp001的基因是双链DNA分子,由54,789-bp组成,一共含有67个开放阅读框,G+C的平均含量为49.42％。通过生物信息学方法分析,对噬菌体Spp001全序列基因进行功能注释。对噬菌体有关裂解基因着重分析,没有找到明确编码穴蛋白的基因,最可能编码内溶素的基因为ORF62。综合分析结果Spp001裂解机制可能是依靠内溶素单独起作用,而不是和孔蛋白共同起作用。
　　为了确定噬菌体 Spp001的裂解活性,通过共沉法提取噬菌体 Spp001裂解液,并利用浊度法和扩散法分析裂解液的活性。结果表明裂解液中含有内溶素,可使OD590在15 min内下降0.160,其底物菌体并未经过任何处理。横向比较裂解液、噬菌体、溶菌酶与死菌、活菌、细胞壁肽聚糖作用15 min的裂解效果,结果表明噬菌体Spp001裂解液裂解细胞壁的活性较好,并且能在较短的时间(5 min)内发挥作用。通过测定碱性磷酸酶(AKP)含量变化和分析透射电镜图片,得出裂解液可导致菌体细胞壁甚至细胞膜破裂。
　　本研究后期分析噬菌体Spp001裂解液反应最适条件,结果表明:裂解液在pH6-8的范围具有较高的酶活力,最适pH为7。在20-30°C下,有较高的酶活力,最适反应温度为30°C。对浊度法测定酶活条件优化后,可使酶活从160 U/mL提高到380 U/mL。同时得出裂解液不需要金属离子保持活力并且有一定的耐盐性和耐热,50°C温育24 h仍可以测到酶活。另外利用外膜通透剂(0.1%Triton-X-100)处理的菌体基底,辅助裂解液更好的发挥裂解效果,酶活进一步提高至404 U/mL。裂解液在4°C下保存9天后失活,-80°C下则损失73.3%。
　　本研究证明Spp001是一株新型腐败希瓦氏菌噬菌体,能够高效表达强裂解活性的内溶素。同时为噬菌体Spp001内溶素的纯化提供理论基础,为扩大Spp001应用范围提供可能性。

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0 前言

0.1 特定腐败菌-腐败希瓦氏菌

0.2 噬菌体基因研究进展

0.3 内溶素研究现状

0.4 本研究的目的和意义

0.5 本文的技术路线

1 腐败希瓦氏菌噬菌体Spp001基因组生物信息学分析

1.1 引言

1.2 实验材料

1.3 实验方法

1.4 实验结果与讨论

1.5 本章小结

2 腐败希瓦氏菌噬菌体裂解液提取及检测方法

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果与讨论

2.5 本章小结

3 噬菌体Spp001裂解液的酶学性质

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果与讨论

3.5 本章小结

4 论文结论

5 创新点

6 下一步工作展望

参考文献

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