久效磷对金鱼(Carassius auratus)甲状腺轴的干扰效应及作用机制研究

摘要

甲状腺激素(THs)三碘甲腺原氨酸(T3)和甲状腺素(T4)对鱼类诸多生理机能具有重要的调控作用。为确定有机磷农药久效磷对鱼类甲状腺轴的干扰效应,本文检测了久效磷农药对雄性和雌性金鱼血浆 THs含量以及下丘脑-垂体-甲状腺轴(HPT轴)不同位点上调控THs合成、转运及代谢等过程的相关基因表达水平的影响,从激素水平和基因水平两个层面较为系统地研究了久效磷农药对 HPT轴的干扰效应及潜在作用机制。此外,久效磷农药可能通过复合作用机制干扰鱼类内分泌系统,本文进一步研究了久效磷(标准品)对雄性和雌性金鱼血浆THs和性激素水平的影响,并以肝脏脱碘酶(d1、d2、d3)、促甲状腺激素(TSH)合成与分泌、促甲状腺激素释放激素(TRH)/促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)调控等多个甲状腺轴内分泌相关因子以及性腺芳香化酶、促性腺激素(GtHs)合成与分泌、促性腺激素释放激素(GnRHs)调控等多个生殖轴线内分泌相关因子为指标,探讨了久效磷干扰金鱼HPT轴和HPG轴的潜在交互作用,以期为可通过影响多个内分泌轴线发挥其内分泌干扰作用的污染物的生态风险评价提供更多理论依据。本文研究结果表明:
　　(1)0.01、0.10和1.00mg/L久效磷农药暴露金鱼21天,能够造成甲状腺滤泡上皮细胞增生、滤泡细胞肥大、胶质缺失等病理学变化。采用放射性免疫法(radioimmunoassay, RIA)检测了血浆中THs含量,结果表明:三个浓度久效磷农药均能够显著降低雄鱼血浆TT3含量及TT3/TT4比值,但对TT4含量无明显影响;血浆FT3和FT4含量分别在0.01、1.00mg/L暴露组和0.10mg/L暴露组显著降低。久效磷农药暴露21天也能够导致雌性金鱼血浆TT3含量及TT3/TT4比值降低;三个浓度久效磷农药均能够导致雌鱼血浆FT3含量显著降低,0.10mg/L久效磷农药能够显著降低血浆FT4含量,但与雄鱼不同的是,雌鱼血浆FT4含量在0.01mg/L暴露组显著升高。由此说明,久效磷农药具有潜在的甲状腺干扰效应,能够造成雄性和雌性金鱼血浆THs水平紊乱。
　　(2)0.01、0.10和1.00mg/L久效磷农药暴露金鱼21天后,采用实时定量PCR方法检测了 HPT轴相关基因表达水平。结果表明:由于脱碘酶在肝脏、脑、肾脏等组织中的分布及作用特点不同,久效磷农药对脱碘酶基因表达水平的影响具有组织特异性。久效磷农药导致金鱼血浆TT3水平降低的主要原因可能与其对肝脏三种脱碘酶基因表达的影响有关,0.01和0.10mg/L久效磷农药对雄鱼和雌鱼肝脏d1和d3基因表达的促进作用明显高于对d2基因表达的促进作用,在促进T4向T3转化的同时更加强了T3代谢;雄鱼中1.00mg/L久效磷农药主要通过下调肝脏d2 mRNA水平,减少了T4向T3的转化,而雌鱼中1.00mg/L久效磷农药仍通过上调d3 mRNA水平,加强TH代谢,最终导致血浆TT3水平降低。由于血浆 T3水平降低的负反馈调节作用,久效磷农药暴露导致金鱼垂体促甲状腺激素(tshβ)mRNA水平上调。血浆FT3水平降低除了与TT3水平降低有关外,可能还与肝脏甲状腺激素运载蛋白(ttr)mRNA水平变化有关。此外,下丘脑trh mRNA水平下调以及crh mRNA水平变化的影响机制较为复杂,可能同久效磷对HPT轴之外的其它因子的影响有关。
　　(3)0.004、0.040和0.400mg/L久效磷(标准品)暴露雄性和雌性金鱼2、4、8、12天后,经RIA和实时定量PCR检测发现,能够造成血浆TT3、TT4、17β-雌二醇(E2)和睾酮(T)水平紊乱,并影响甲状腺轴和生殖轴线不同位点相关基因表达水平。久效磷标准品短时间暴露的实验结果同久效磷农药暴露21天的实验结果并不完全一致,但从中我们推测,久效磷对甲状腺轴和生殖轴线的干扰作用可能存在一定程度上的交互影响。久效磷暴露2天和4天,对肝脏d2和d3基因表达的抑制作用可能同其导致的E2水平升高有关;通过久效磷对金鱼性腺中甲状腺激素受体(TRα-1和TRβ)基因表达水平的影响推测,性腺芳香化酶基因表达水平的升高可能与久效磷暴露造成的T3含量减少存在一定关系。
　　综上,本研究表明,久效磷农药对雄性和雌性金鱼甲状腺轴具有潜在的干扰效应,能够造成血浆THs水平紊乱,进而可能影响依赖THs调控的相关生理机能。HPT轴不同位点上调控THs合成、转运及转化等过程的相关基因对久效磷农药暴露较为敏感,其中,久效磷农药对肝脏、脑和肾脏等外周组织脱碘酶基因表达水平影响尤为显著且具有组织特异性。此外,久效磷农药的有效成分—久效磷短时间暴露,能够影响雄性和雌性金鱼血浆THs和性激素水平以及HPT轴和HPG轴相关基因表达水平。由此我们推测,久效磷通过复合作用机制干扰鱼体
　　内分泌系统,其对这两条内分泌轴线的影响间可能存在潜在的交互作用,但尚需结合更多的体外实验为此提供更为可靠的理论依据。

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0 前言

1 环境内分泌干扰物对鱼类甲状腺轴的干扰作用及其机制研究进展

1.1 鱼类甲状腺轴研究进展

1.2 环境内分泌干扰物对鱼类甲状腺轴的干扰作用及其机制研究进展

1.3 研究展望

1.4 研究目的和技术路线

2 久效磷农药对金鱼血浆甲状腺激素水平及甲状腺滤泡组织的影响

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4 小结

3 久效磷农药干扰金鱼HPT轴，导致血浆THs水平失衡的潜在分子机制

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 小结

4 久效磷对金鱼HPT轴和HPG轴的交互作用影响研究

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

4.4 小结

5 结论与创新点

5.1结论与展望

5.2创新点

参考文献

缩略词表

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