牙鲆(Paralichthys olivaceus)干细胞多能性相关转录因子Oct4、Nanog和Sox2的克隆与分析

摘要

我国是水产养殖大国,近年来随育种技术的发展已培育出大量水产优良品种。而建立水产生物完整遗传信息长期稳定的保存方法,对于有利地保护濒危生物资源,实现优良品种和品系优质遗传资源的稳定保存和利用具有十分重要的意义。干细胞具有无限的自我更新及分化成为胚胎的三个胚层的能力,是解决种质资源保护的良好介质,而目前也已有多个鱼类胚胎干细胞系成功建立的报道。关于维持干细胞自我更新和多潜能性的分子机制,在哺乳动物中已经开展了大量的研究工作,主要集中于Oct4、Nanog和Sox2等转录因子形成的核心调控网络,而在重要海水养殖物种牙鲆中,相关研究的技术手段和分子机理还未见报道。本论文克隆得到了这三个重要转录因子,并对其基因结构、调控序列及表达模式等方面进行了初步的分析,为下一步的深入研究奠定基础。
　　牙鲆Oct4基因全长3978 bp,由5个外显子和4个内含子组成,其cDNA序列全长2654/3098 bp,包括1428 bp的开放阅读框(ORF),352 bp的5′UTR和长度分别为874 bp和1318 bp的3′ UTR。预计编码475个氨基酸残基的蛋白并含有特征性的POU结构域,由POU特异结构域、POU同源结构域以及二者之间的连接域组成。系统进化树、基因结构以及染色体同线性等分析证实了我们克隆得到了与哺乳动物Oct4基因同源的牙鲆Oct4基因。通过两次染色体步移,扩增得到了3975 bp的牙鲆Oct4基因完整启动子区序列。对其进行生物信息学分析,预测存在丰富的顺式作用元件和潜在的转录因子结合位点,多为参与调控维持干细胞多能性的转录因子及相关信号通路关键作用因子,预示着它们在参与维持胚胎干细胞多能性方面潜在的功能。荧光定量RT-PCR结果显示Po-Oct4为母源性表达,至桑葚胚时期激活合子基因表达量升高,囊胚期表达量上升达到最大值,随着原肠作用的进行,表达量逐渐降低,原肠晚期骤然降低,至心跳期已几乎检测不到转录本。两种转录本的表达模式基本一致,短转录本表达量较长转录本高。整体原位杂交显示信号分布于整个分裂球。组织特异性表达分析显示Po-Oct4仅在成体性腺组织中表达,且在卵巢中的表达量显著高于精巢。通过原位杂交和免疫组织化学分析,分别从mRNA和蛋白质水平上研究了Po-Oct4的细胞定位情况,结果显示在卵巢中定位于卵原细胞和各发育阶段的卵母细胞中;在精巢中仅定位于精原细胞,而在精母细胞及精细胞中均无杂交信号。
　　牙鲆Nanog基因全长2416bp,由4个外显子和3个内含子组成,其cDNA序列全长为1839 bp,包括1260 bp的ORF,120 bp的5′UTR和459bp的3′UTR。预计编码419个氨基酸残基的蛋白,含有一个60个氨基酸残基长的同源结构域。蛋白质序列比对显示在该保守的同源结构域之外序列的保守性非常低。系统进化树、基因结构以及染色体同线性等分析证实了我们克隆得到了与哺乳动物Nanog基因同源的牙鲆Nanog基因。通过染色体步移及后续的生物信息学分析,在扩增得到的2400 bp牙鲆 Nanog基因完整启动子序列上预测存在着丰富顺式作用元件与潜在的转录因子结合位点,这些转录因子多数与干细胞的多能性相关。在转录起始位点上游还预测到一段约150 bp长的含有TATA框、CAAT框及GC框等元件的潜在核心启动子序列,并且包含转录起始位点的这段序列在物种间保守,推测该核心启动子对基因的转录起始起关键的调控作用。荧光定量RT-PCR结果显示Po-Nanog为母源性表达,随着卵裂的进行,表达量先降低随后逐渐升高,在囊胚期表达量最高,原肠早期表达量骤然下降并逐渐降低,至心跳期基本检测不到转录本。通过整体原位杂交分析细胞定位情况,结果显示表达信号分布于整个卵裂球。组织特异性表达分析显示Po-Nanog仅在成体性腺组织中表达,且在卵巢中的表达量高于精巢。Po-Nanog转录本在卵巢中定位于卵原细胞和各发育阶段的卵母细胞中;在精巢中仅定位于精原细胞,而在精母细胞及精细胞中无杂交信号。
　　牙鲆Sox2基因仅由一个外显子组成,无内含子结构,cDNA序列全长2262 bp,包括969 bp的ORF,352 bp的5′UTR和941 bp的3′UTR。预计编码322个氨基酸残基的蛋白,含有特征性的HMG盒DNA结合结构域及SOXp转录因子结构域。对克隆得到1916 bp的牙鲆Sox2基因启动子序列进行生物信息学分析,显示存在着多种与干细胞多能性及神经发生相关的转录因子结合位点,如Oct3_4、NANOG、NeuroD等。在启动子区域中还发现存在三段总长度约为200 bp的遗传位置上连续的物种间保守序列,其上存在一些重要的转录因子结合位点,推测它们对于基因的转录与表达起到重要的调控作用。荧光定量RT-PCR结果显示Po-Sox2为合子表达,至囊胚期开始表达,在原肠期表达量最高达到峰值,从原肠后期开始表达量逐渐降低至维持在一定的低表达水平。在成体组织中,Po-Sox2在脑中表达量最高,鳃中次之,在卵巢和精巢中也有一定量的表达,脾脏和肾脏中有微弱的表达,其它组织中不表达。其中在脑组织的端脑中表达量最高,在延脑、小脑、中脑和间脑中的表达量依次降低。原位杂交结果显示,在卵巢中, Po-Sox2定位于卵原细胞和卵母细胞的胞质,且随卵母细胞的发育信号强度减弱;在精巢中,与牙鲆Oct4和Nanog基因结果一致,仅定位于精原细胞中。

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第一章 文献综述

第一节 干细胞及其研究进展

第二节 维持干细胞多能性重要转录因子

第三节 本研究的目的意义与实验设计

第二章 牙鲆（Paralichthys olivaceus）多能性转录因子Oct4的克隆与分析

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果

2.4 讨论

第三章 牙鲆（Paralichthys olivaceus）多能性转录因子Nanog的克隆与分析

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四章 牙鲆（Paralichthys olivaceus）多能性转录因子Sox2的克隆与分析

4.1 引言

4.2 材料和方法

4.3 结果

4.4 讨论

参考文献

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