微生物脂肪酶库构建及磷脂酶D的筛选与应用

摘要

脂肪酶作为工业大宗酶之一，能够催化水解、酯合、酯交换、醇解、酸解、氨解等反应，被广泛地用于食品、医药、纺织、饲料、洗涤、造纸、生物柴油及环境保护等领域。微生物脂肪酶相比于动植物 来源脂肪酶具有来源广泛、易于制备、底物特异性较强、催化效率较高、反应条件温和、副产物较少等优点。伴随着脂肪酶应用范围的扩大，对其特异性的要求也逐渐提高，从自然界中筛选特异性脂肪酶菌株是一个较为简便可行的方法。
　　利用维多利亚蓝和皂化钙圈的方法我们从19份内陆土壤样品和22份南海深海沉积物样品中平板初筛获得538株产酶菌株。复筛我们采用特异性酶活测定方法，脂肪酶水解活力采用p-NP法，磷脂酶D水解酶活力采用酶联比色法，酯合活力采用棕榈酸乙酯法，转酯活力采用DHA甘油酯法。复筛结果显示538株初筛菌株中具有脂肪酶水解活力的菌株有295株;具有PLD水解活力菌株有293株;具有酯合成活力的菌株有138株;具有酯交换活力的菌株有23株。具有较高水解活力的菌株有57株;较高PLD水解活力的菌株有55株;较高酯合活力的菌株有3株。其中水解酶和PLD酶的相关度为45.08％，水解酶和酯合酶的相关度为27.5％，酯合酶和酯交换酶的相关度为82.1％。我们对部分南海特异性菌株进行了16S rDNA鉴定分析，发现变形杆菌门占绝对优势，其中嗜冷菌、芽孢杆菌、交替假单胞菌为优势菌属。
　　脂肪酶库中538号菌株经过16S rDNA鉴定为麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia)，通过硫酸铵沉淀、DEAE离子交换层析和凝胶过滤层析获得电泳纯蛋白条带。蛋白质测序发现其属于Ⅰ型磷脂酶含有GxSxG保守序列，相对分子质量为41.8 KD，等电点为8.86。酶学性质研究发现该酶最适的催化温度为40℃，最适pH为7-8，在10-40℃内能够保持酶活的稳定性，在pH5-12的范围内能够维持80％以上活力，金属离子Fe3+和化学试剂SDS能够抑制90％以上的酶活。
　　磷脂酶D（Phospholipid D，EC3，1.4.4，缩写PLD）能够催化水解磷脂分子中4位酯键，生成磷脂酸和有机碱;同时，还能通过碱基交换反应催化各种羟基化合物与磷脂碱基结合形成新的磷脂。目前报道的大部分PLD的水解活性远高于转碱基活性，这限制了其在制备单一磷脂和稀有磷脂等磷脂改性过程的应用。本研究以脂肪酶库中具有PLD水解活力菌株及大豆磷脂残渣为样品筛选具有碱基交换活性的PLD菌株，并将其用于磷脂酰丝氨酸合成。通过大量的筛选我们共获得了6株具有磷脂酰丝氨酸合成能力菌株，分别对其进行了16S rDNA鉴定。其中a2菌株经过鉴定为抗辐射不动杆菌（Acinetobacter radioresistens），其在双相体系中50℃反应12h磷脂酰丝氨酸的转化率为47.8％，选择率为74％，具有很好的应用前景。
　　利用H103大孔树脂对Acinetobacter radioresistens a2的PLD进行纯化。一步纯化获得了电泳纯PLD蛋白，其相对分子量在40 KD左右。

目录

声明

摘要

0 前言

0．1 脂肪酶

0．1．1 脂肪酶简介

0．1．2 脂肪酶特性

0．1．3 脂肪酶的应用

0．2 磷脂改性与磷脂酶D

0．2．1 磷脂简介

0．2．2 磷脂酰丝氨酸简介

0．2．3 磷脂改性的方法

0．2．4 磷脂酶D简介

0．2．5 磷脂酶D的催化特性

0．3 研究意义和主要研究内容

0．3．1 研究意义

0．3．2 研究内容

1 微生物脂肪酶库构建及南海产脂肪酶微生物多样性分析

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．2．1 样品信息

1．2．2 仪器与试剂

1．2．3 培养基配方

1．2．4 产脂肪酶微生物筛选

1．2．5 细菌16S rDNA鉴定

1．3 结果与讨论

1．3．1 产酶微生物酶活多样性分析

1．3．2 南海产脂肪酶微生物多样性分析

1．4 本章小结

2 嗜麦芽寡养单胞菌LH15脂肪酶的纯化及酶学性质研究

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 仪器与试剂

2．2．2 菌株

2．2．3 培养基配方

2．2．4 酶活测定方法

2．2．5 蛋白质测定方法

2．2．6 LH15生长曲线测定

2．2．7 LH15纯化

2．2．8 SDS-PAGE检测

2．2．9 LH15酶学性质

2．2．10 蛋白测序

2．3 结果与讨论

2．3．1 LH15的生长曲线

2．3．2 LH15进化分析

2．3．3 LH15脂肪酶的纯化

2．3．4 SDS-PAGE检测

2．3．5 LH15脂肪酶的酶学性质

2．3．6 蛋白测序

2．4 本章小结

3 具有转碱基活性的磷脂酶D菌株筛选

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 样品信息

3．2．2 仪器与材料

3．2．3 培养基配方

3．2．4 具有转碱基活性的PLD菌株筛选

3．2．5 双水相磷脂酰丝氨酸合成

3．2．6 磷脂酰丝氨酸检测

3．2．7 细菌鉴定及进化分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 脂肪酶库筛选结果

3．3．2 大豆磷脂残渣中筛选

3．3．3 具有转碱基活性菌株16S rDNA鉴定

3．3．4 具有转碱基活性菌株进化分析

3．4 本章小结

4 抗辐射不动杆菌a2催化合成磷脂酰丝氨酸及其发酵纯化

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 仪器与试剂

4．2．1 材料

4．2．3 a2催化合成磷脂酰丝氨酸

4．2．4 磷脂酰丝氨酸检测

4．2．5 a2PLD纯化

4．2．6 磷脂酶D水解活力测定

4．2．7 蛋白质含量测定

4．2．8 SDS-PAGE电泳

4．3 结果与讨论

4．3．1 a2 PLD催化合成PS

4．3．2 a2 PLD纯化

4．4 本章小结

5 总结与展望

5．1 引言

5．2 总结

5．3 本论文的不足

5．4 展望

参考文献

致谢

个人简历