PEAR技术制备修饰性寡核苷酸及大肠杆菌移码突变恢复相关研究

摘要

人工合成的寡核苷酸在基因调控方面有重要而广泛的用途。一些寡核苷酸，例如反义寡核苷酸、CpG寡核苷酸和核酸适配体等已经成功应用于基因治疗上。但是，大量制备寡核苷酸不仅困难而且花费特别高。这不仅需要昂贵的合成仪器而且需要繁琐的纯化程序，因为化学合成的寡核苷酸含有大量的错误序列。之前，本实验室报道了一种“聚合酶-内切酶扩增反应”，可以用来制备非修饰性和硫代修饰性寡核苷酸。本文将这种技术延伸用于制各氟代修饰以及氟硫混合修饰寡核苷酸。实验结果显示，KOD DNA聚合酶和Phusion DNA聚合酶都可以用来扩增含有一种或两种修饰碱基的寡核苷酸，但是KOD DNA聚合酶在扩增氟代和氟硫双代寡核苷酸时更具优势。之后用质谱检测了PEAR产物成分，证明PEAR扩增具有极高的准确性。PEAR产物经完全酶切，所有缩短了的产物量非常低(4.8％)，全长产物比例达到95.2％，全长修饰性产物比例达到89.2％。PEAR反应能有效地合成修饰性寡核苷酸。并且拥有诸多优点，例如:成本低、无污染、产物纯度高、纯化简单、容易扩大规模。我们相信，这种技术是一种有用的酶促合成寡核苷酸方法。
　　另外，同源重组不仅在生物进化中起重要的作用，而且成为定向改造基因的技术。据报道，微生物可以吸收外界单链DNA，并且在体内将外界DNA插入到基因组同源区域内，从而造成基因组的定点突变。我们将双链DNA及经过化学修饰的双链DNA导入细菌体内时，预期遗传重组的效率可能会有所提高。为此，我们选取质粒pBR322为研究对象，设计了其β-内酰胺酶基因移码突变体。在外源单链野生型寡核苷酸的作用下，移码突变位点可以被定向修复，检测到少量恢复突变体。然而，双链寡核苷酸非但没有提高修复效率，反而没有检测到恢复突变体。同时发现，在没有寡核苷酸介导的情况下，移码突变也可以自发恢复。对回复突变菌株进行传代培养，观察到其存活率和生长速率随着代数增加而逐渐增长的现象，移码突变后读码框恢复不是快速的而是渐进式的。对自发恢复的菌株进行了测序分析，结果显示，在抗生素的筛选作用下，在移码突变位点前后不同位置插入随机的碱基，进而定向修复了移码突变。

目录

声明

摘要

第一章 PEAR技术制备修饰性寡核苷酸

1 前言

1．1 反义寡核苷酸

1．2 其他类型寡核苷酸

1．3 寡核苷酸扩增技术

1．4 寡核苷酸大规模制备技术存在的问题

1．5 PEAR技术

1．7 核酸质谱分析技术

2 研究内容和意义

3 材料和方法

3．1 实验材料

3．2 实验方法

4 结果和讨论

4．1 结果

4．2 PEAR技术优势

4．3 讨论

5 结论

第二章 移码突变恢复相关研究

1 前言

1．1 移码突变

1．2 定点诱变

1．3 遗传重组

1．4 回复突变

2 研究内容和意义

3 材料和方法

3．1 实验材料

3．2 实验方法

4 结果与讨论

4．1 结果与分析

4．2 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

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