白斑综合征病毒(WSSV)胶体金免疫半定量快速检测试纸条的研制与应用

摘要

白斑综合征病毒(WSSV)是在全世界范围内为虾类养殖业带来损失最大的病毒之一，且目前尚缺乏有效的治疗措施，因此在WSSV感染的早期，能够实现对WSSV快速、定量检测，为预防控制该病的暴发、预警预报和减少经济损失具有重要意义。针对WSSV定量检测目前常采用聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR、双抗体夹心ELISA等方法，但是现有的这些检测方法在实际应用中皆在不同程度上受到花费高、耗时长、需要专业仪器等方面的限制，针对上述情况，本实验研制了一种WSSV胶体金免疫层析半定量快速检测试纸，其检测结果肉眼可见，不需要专业仪器设备，整个过程仅需要10min，适用于养殖现场的虾类、蟹类等甲壳类中WSSV的半定量快速检测。
　　本实验具体如下所述，复苏WSSV单克隆抗体杂交瘤细胞2E6、1G12、3B7、4G9和5D2，利用辛酸-硫酸铵法纯化腹水单抗。选择单抗2E6作为金标抗体，以柠檬酸钠还原法制备胶体金，通过胶体金标记单抗2E6制备金标抗体，使用喷膜仪将制备的金标单抗2E6液体均匀喷涂到玻璃纤维上，即为金标垫，分别将不同浓度的单抗4G9包被于硝酸纤维素膜(NC膜)分别作为检测线T1，检测线T2和检测线T3，将羊抗小鼠IgG包被于硝酸纤维素膜(NC膜)，作为质控线。并组装金标垫、NC膜与样品垫、吸收垫和塑料底板制成WSSV胶体金免疫层析半定量快速检测试纸。另外对其进行了优化，选择Whatman AE99作为WSSV检测试纸条的NC膜，单抗1G12、3B7、4G9、5D2按4∶2∶2∶1的比例混合作为试纸条检测线抗体，优化后的试纸条的最低检测限为783ng/ml。使用WSSV胶体金免疫层析半定量快速检测试纸检测样品，若检测线T1、T2、T3和质控线都呈现红色时，说明WSSV蛋白浓度大于6.26μ g/ml;若检测线T1、T2和质控线显现红色时，说明WSSV蛋白浓度位于3.13μ g/ml～6.26μ g/ml之间;若只有检测线T1和质控线显现红色时，说明WSSV蛋白浓度位于783ng/ml～3.13μ g/ml;若只有质控线显现红色时，表明WSSV蛋白浓度小于783ng/ml，或者不含WSSV。
　　建立了白斑综合征病毒实时荧光定量PCR技术，分别利用制备的WSSV胶体金免疫层析半定量快速检测试纸和建立的WSSV实时荧光定量PCR技术，跟踪检测了感染WSSV后克氏原螯虾（Procambarus clarkii）组织内病毒浓度的动态变化。注射WSSV粗提液感染克氏原螯虾，在感染后0h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h和72h分别取螯虾鳃、血淋巴、心脏、附肢、造血组织和肌肉，提取各组织DNA，实时荧光定量PCR测定WSSV浓度，结果显示，WSSV感染后3h在附肢、鳃、血淋巴和造血组织中检测到病毒，12h时在各样品组织中皆检测到病毒，但浓度较低;24～48h内WSSV浓度呈指数增长，此时螯虾出现少量死亡;60～72h内各组织中WSSV数量达到缓慢增长的平台期，螯虾累计死亡率快速增高。螯虾体内WSSV浓度与螯虾死亡率呈密切的正相关关系，其中附肢中WSSV动态变化趋势能够较好的代表多数样品组织中的WSSV增殖规律，因此在实验室及养殖场WSSV检测中可将附肢作为首选的检测组织。在感染WSSV后不同时间点WSSV在各组织中的分布也有很大差异，分析各组织中WSSV分布的差异，推测WSSV最先在血淋巴中大量复制，随后由于血淋巴循环造成对其它组织的感染。使用WSSV胶体金免疫层析半定量快速检测试纸检测血淋巴、鳃中不用时间点WSSV浓度，结果显示试纸条所测样品结果与实时荧光定量PCR检测结果一致率为100％。因而，WSSV胶体金免疫层析半定量快速检测试纸是一种快速、准确、适合于养殖现场使用的WSSV半定量检测方法。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 白斑综合征病毒概述

1．2 白斑综合征病毒检测方法

1．3 胶体金免疫层析试纸条研究进展

2．白斑综合征病毒(WSSV)胶体金免疫层析半定量快速检测试纸条的研制

2．1 胶体金标记WSSV单克隆抗体的制备

2．2 白斑综合征病毒(WSSV)胶体金免疫层析半定量快速检测试纸条的制作

2．3 白斑综合征病毒胶体金免疫层析半定量快速检测试纸条的优化

2．4 白斑综合征病毒胶体金免疫层析半定量快速检测试纸条定量范围、特异性、重复性与稳定性的检测

3 白斑综合征病毒(WSSV)胶体金免疫层析半定量快速检测试纸条的应用

3．1 实时荧光定量PCR技术检测人工感染白斑综合征病毒克氏原螯虾体内白斑综合征病毒动态变化

3．2 使用白斑综合征病毒胶体金免疫层析半定量快速检测试纸条检测人工感染白斑综合征病毒克氏原螯虾体内病毒动态变化

参考文献

致谢

个人简历

硕士期间发表文章