叉枝松藻抗凝血多糖及其寡糖的制备和结构研究

摘要

叉枝松藻，又名叉开松藻，属于绿藻门、松藻目、松藻科、松藻属，多生长在中、低潮带的岩石上或石沼中。本论文以采自我国黄海海域的叉枝松藻为研究对象，采用各种色谱分离技术，获得叉枝松藻的纯品多糖，采用化学法、色谱法、波谱法对其组成和结构进行研究，并对结构新颖的叉枝松藻多糖进行降解研究，建立可控酸降解方法制备低分子量多糖及寡糖，通过核磁共振技术和质谱法，对获得的低分子量多糖及寡糖进行结构研究，并测定了叉枝松藻多糖及各种低分子量多糖的抗凝血活性。研究结果如下:
　　1.以叉枝松藻为原料，依次采用冷水、热水和0.5mol/L NaOH溶液提取多糖，分别得到3个多糖组分CP、HP和AP，相对于干燥藻体的得率分别为10.72％、8.41％和1.54％，并对其理化性质和单糖组成进行分析。结果表明，CP、HP和AP均为硫酸化多糖，总糖含量分别为66.7％、65.4％和44.3％;硫酸基含量分别为25.6％、11.8％和28.2％; AP的蛋白含量最高为20.4％。3种粗多糖的主要单糖组成均为半乳糖，另外还含有数量不等的阿拉伯糖、葡萄糖和甘露糖。
　　2.叉枝松藻的冷水提粗多糖CP和热水提粗多糖HP，首先采用Q-SepharoseFast F low强阴离子色谱柱分离纯化，获得CP1、CP2和HP1三个组分，经SephacrylS-400凝胶柱层析进一步纯化，得到3个纯品多糖组分CP1-1、CP2-1和HP1-1。通过化学方法对多糖的理化性质进行测定，结果表明，CP1-1、CP2-1和HP1-1的总糖含量分别为62.4％、64.8％和78.1％;蛋白含量分别为0.5％、0.4％和3.1％;硫酸基含量分别为30.4％、23.7％和12.3％;糖醛酸含量分别为4.5％、3.2％和6.7％;CP2-1的丙酮酸含量为6.6％。采用高效凝胶渗透色谱法测定三种多糖的分子量分别为203kDa、37.9kDa、297kDa。采用PMP柱前衍生高效液相色谱法测定单糖组成，结果表明，CP1-1主要由阿拉伯糖和半乳糖组成;CP2-1主要含有半乳糖;HP1-1主要含有葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。另外，采用高效液相色谱法测定多糖中主要单糖种类的绝对构型，阿拉伯糖的绝对构型为L，半乳糖和葡萄糖的绝对构型为D。
　　通过红外光谱、脱硫反应、甲基化后GC-MS分析和1D，2D NMR对多糖结构进行解析，CP1-1、CP2-1和HP1-1的结构各不相同。CP1-1主要含有[→4)-β-L-Arap-（1→]、[→3)-β-D-Galp-（1→]、[β-D-Galp-(1→]和[→3，4)-β-D-Galp-（→]连接方式，硫酸基取代于1，4连接阿拉伯糖的C-3位和1，3连接半乳糖的C-4位。CP2-1是半乳聚糖，以1，3连接半乳糖为主链，含有[→3)-β-Galp-(1→]、[→3,4)-β-Galp-(1→]、[→3)-β-(4SO4)-Galp-(1→]、[β-(3，4-Pyr，6SO4)-Galp-(1→]，硫酸基取代于1，3连接半乳糖的C-4位和非还原末端半乳糖的C-6位，丙酮酸在非还原末端半乳糖的C-3和C-4位形成五元环。HP1-1含有[→4)-α-Glcp-(1→]、[→3)-α-Glcp-(1→]、[→3，4)-α-Glcp-(1→]、[→4)-β-Arap-(1→]、[β-D-(3，4Pyr)-Galp-(1→]、[→3)-β-D-Galp-（1→]多种连接方式，少量硫酸基位于1，4连接葡萄糖的C-3位和1，3连接半乳糖的C-4位。通过APTT、PT和TT，对多糖CP1-1、CP2-1和HP1-1的抗凝血活性进行评价，结果表明，CP1-1、CP2-1和HP1-1均具有体外抗凝血活性，但低于肝素。
　　3.采用硫酸对叉枝松藻多糖CP1进行降解，通过薄层色谱法和高效凝胶渗透色谱法对降解产物进行分析，优化降解条件。最终选用0.05mol/L硫酸于40℃水浴中降解1.5h和0.01 mol/L硫酸于60℃水浴中降解3h两种条件对多糖CP1进行降解，采用凝胶色谱Sephacryl S-400分离纯化，获得6个低分子量多糖组分L1～L6，分子量分别为369kDa、242kDa、124kDa、102kDa、43kDa、22kDa。对其进行化学组成分析，6种低分子量多糖均由阿拉伯糖和半乳糖组成，只是单糖的比例有所不同，硫酸基含量在22.5％～29.9％范围内，与母体多糖的化学组成相似。以抗凝血活性较好、分子量较小的L5为代表，通过GC-MS和1D，2D NMR对L5进行结构解析，结果表明，多糖L5主要含有[→3)-Galp-(1→]、[→4)-Galp-(1→]、[→4)-Arap-(1→]等连接方式，硫酸基位于1，3连接半乳糖的C-2和C-4位，1，4连接半乳糖的C-2位，1，4连接阿拉伯糖的C-3，L5为高度硫酸化的阿拉伯半乳聚糖。采用APTT测定多糖CP1及降解产物L1～L6的抗凝血活性，结果表明，多糖的抗凝血活性随着分子量的减小而降低，说明一定长度的多糖链是必需的，分子量对叉枝松藻多糖的抗凝血活性具有重要影响。
　　4.叉枝松藻多糖CP2-1通过三氟乙酸降解，经Bio-Gel P4凝胶色谱柱分离纯化后，得到8个不同聚合度的寡糖组分F1～F8，并对其纯度进行分析。通过负离子模式的电喷雾一级质谱(ES-MS)对寡糖的组成成分进行分析，结果表明，F1～F8为聚合度(DP)在1～11之间的半乳寡糖，且有丙酮酸和硫酸基取代。以纯度较高、由G2S组成的F3为代表进行核磁和二级质谱分析，确定其结构为β-D-Galp-(4SO4)-(1→3)-D-Gap，并建立硫酸化半乳寡糖负离子模式下ES-CID-MS/MS二级质谱序列分析方法。将此方法用于其它半乳寡糖的分析，结果表明，获得的半乳寡糖均通过1→3糖苷键相连，硫酸基多数在1，3连接半乳糖的C-4位，少数在非还原末端半乳糖的C-6位，丙酮酸在非还原末端半乳糖的C-3和C-4位形成五元环。通过分析归属半乳寡糖的断裂碎片，建立了半乳寡糖ES-CID-MS/MS二级质谱序列分析方法，有助于多糖及寡糖结构的研究，获得的半乳寡糖是结构新颖的海洋特征寡糖。
　　本论文的研究成果，加深了人们对叉枝松藻多糖结构和活性的认识，为开发利用叉枝松藻奠定了基础，丰富了“海洋糖库”的数据资源，对发展具有我国特色的海洋药物具有重要意义。

目录

声明

摘要

前言

1 绿藻多糖的研究进展

1．1 绿藻多糖结构的研究进展

1．2 绿藻多糖活性的研究进展

2 多糖的提取和纯化方法

2．1 多糖的提取方法

2．2 多糖的分离纯化方法

2．3 多糖的纯度分析及分子量测定

3 多糖结构研究方法

3．1 多糖一级结构研究

3．2 多糖高级结构研究

4 寡糖的研究

4．1 寡糖的制备方法

4．2 寡糖的分离纯化

4．3 寡糖的结构研究方法

4．4 寡糖的生物活性

5 本课题的立题背景和研究意义

第一章 叉枝松藻多糖的提取和理化性质研究

1 实验材料与仪器

1．1 实验原料

1．2 实验试剂

1．3 实验仪器

2 实验方法

2．1 乙醇脱脂

2．2 叉枝松藻多糖的提取

2．3 叉枝松藻多糖的理化性质研究

2．4 单糖组成分析

3 实验结果与讨论

3．1 乙醇脱脂

3．2 叉枝松藻多糖的提取

3．3 理化性质测定

3．4 单糖组成测定

4 小结

第二章 叉枝松藻多糖的分离纯化及结构研究

1 实验材料与仪器

1．1 实验原料

1．2 实验试剂与材料

1．3 实验仪器

2 实验方法

2．1 多糖的分离纯化

2．2 理化性质分析

2．3 分子量测定及纯度分析

2．4 单糖组成分析

2．5 单糖绝对构型(D／L)的测定

2．6 红外光谱分析

2．7 脱硫酸基反应

2．8 甲基化反应及气质分析

2．9 核磁共振波谱分析

2．10 抗凝血活性分析

3 实验结果与讨论

3．1 多糖的分离纯化

3．2 理化性质分析

3．3 分子量测定

3．4 单糖组成分析

3．5 单糖绝对构型(D／L)的测定

3．6 红外光谱分析

3．7 甲基化及GC-MS分析

3．8 核磁共振波谱分析

3．9 抗凝血活性分析

4 本章小结

第三章 叉枝松藻低分子量多糖的制备、结构和抗凝血活性研究

1 实验材料与仪器

1．1 实验原料

1．2 实验试剂与材料

1．3 实验仪器

2 实验方法

2．1 多糖CP1酸降解条件的优化

2．2 低分子量多糖的制备

2．3 化学组成分析

2．4 脱硫酸基反应

2．5 甲基化反应及气质分析

2．6 核磁共振波谱分析

2．7 抗凝血活性分析

3 实验结果与讨论

3．1 多糖CP1酸降解条件的优化

3．2 低分子量多糖的制备

3．3 化学组成分析

3．4 甲基化反应及GC-MS分析

3．5 核磁共振波谱分析

3．6 抗凝血活性分析

4 本章小结

第四章 寡糖的制备与结构研究

1 实验材料与仪器

1．1 实验原料

1．2 实验试剂与材料

1．3 实验仪器

2 实验方法

2．1 寡糖降解条件摸索

2．2 寡糖制备及分离纯化

2．3 寡糖纯度分析

2．4 质谱分析

2．5 单糖组成分析

2．6 甲基化反应及GC-MS分析

2．7 核磁共振波谱分析

3 实验结果与讨论

3．1 寡糖制备及分离纯化

3．2 寡糖纯度分析

3．3 一级质谱分析

3．4 单糖组成

3．5 甲基化反应及气质分析

3．6 核磁共振波谱分析

3．7 二级质谱分析

4 本章小结

参考文献

结语

创新点

研究成果

致谢

个人简介