硫化物胁迫对单环刺螠(Urechis unicinctus)ROS介导的呼吸肠细胞凋亡初探

摘要

过量的硫化物会抑制细胞色素c氧化酶的活性，阻断线粒体中的电子传递，导致活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的增加与积累，进而对细胞中的脂质、蛋白质、核酸引起损伤。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)能够催化超氧阴离子生成过氧化氢和氧，随后在过氧化氢酶的催化下，将过氧化氢分解为水和氧，从而减低ROS对机体的损伤。当细胞中ROS的含量超出SOD清除能力时，过量的ROS会造成线粒体通透性的改变，导致细胞色素c由线粒体释放至细胞质中，进而活化了细胞凋亡分子Caspase-3。活化的Caspase-3将使DNA修复酶降解，导致被破坏的DNA无法被修复，引起细胞凋亡。单环刺螠Urechis unicinctus是一种生活在沿海泥沙底质“U”形洞穴中的螠虫动物，在低潮时期其通常由于洞穴内的硫化物含量升高而处于富硫环境中。本文在实验室模拟硫化物环境下，采用邻苯三酚自氧化法检测了单环刺螠呼吸肠组织中SOD活性的变化;使用DCFH探针检测了呼吸肠组织中ROS在各实验组中的含量;采用免疫印迹试验(Western Blot)技术确定了单环刺螠呼吸肠中Caspase-3蛋白含量随硫化物暴露的变化;初步揭示了硫化物暴露下，单环刺螠ROS介导的后肠细胞凋亡现象。主要结果如下:
　　单环刺螠暴露在硫化物环境中时，其呼吸肠中SOD活性在50μmol/L硫化物暴露24 h时达到最高，为对照组的1.3倍;之后其活性逐渐降低，至72 h达到最低，为对照组的29％。在150μmol/L硫化物处理组中，呼吸肠SOD活性于暴露后6h时达到最高，为对照组的1.6倍，之后其活性逐渐降低，至72 h达到最低，为对照组的61％。表明硫化物的暴露，可引起单环刺螠呼吸肠中SOD活性短期升高，之后活性受到抑制。
　　单环刺螠呼吸肠中ROS的含量在硫化物暴露6h后呈显著提高(p＜0.05)，并且这种显著提高的趋势一直维持到实验结束。但是，50μmol/L硫化物组的ROS含量总是低于相同处理时间150μmol/L硫化物组，在72 h时分别为对照组的3.8倍与4.5倍。表明单环刺螠暴露在硫化物中时，其呼吸肠细胞中ROS发生了的积累。
　　本实验使用RACE技术获得单环刺螠Caspase-3全长cDNA序列，将其ORF（开放阅读框）序列连接到pET28a载体中，体外原核诱导表达获得Caspase-3重组蛋白并制备了多克隆抗体;Western blot检测发现，单环刺螠呼吸肠中Caspase-3蛋白在50μmol/L硫化物组中的含量与对照组无统计学差异(p＞0.05)。在150μmol/L硫化物组中，其Caspase-3在暴露24 h时的表达量显著提高(p＜0.05)，约为对照组的1.37倍;之后，Caspase-3蛋白含量持续增加，在48 h与72h的表达量分别为对照组的1.57倍与1.8倍。推测单环刺螠在50μmol/L硫化物中，其呼吸肠细胞没有发生明显的细胞凋亡现象;但150μmol/L硫化物的暴露可能引起呼吸肠组织细胞的凋亡。
　　综上可见，单环刺螠暴露在硫化物环境中，其呼吸肠中ROS含量和SOD活性存在负相关关系，推测单环刺螠呼吸肠中SOD对ROS具有一定的清除作用;结合Caspase-3的结果，得出单环刺螠在50μmol/L硫化物环境中，其呼吸肠中ROS的累积不能导致机体明显的损伤，但在150μmol/L硫化物中，呼吸肠中ROS含量的累积使Caspase-3蛋白量显著升高，导致细胞发生凋亡。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1 硫化物的生物学功能和危害

1．1 硫化氢对生物体生理活动的调控作用

1．2 硫化物对生物的毒性

2 ROS的研究进展

2．1 活性氧的产生

2．2 活性氧的危害

3 超氧化物歧化酶的研究进展

3．1 超氧化物歧化酶的结构特征

3．2 超氧化物歧化酶的功能

4 Caspase-3的研究进展

4．1 Caspase-3的结构特征

4．2 Caspase-3相关功能研究

5 研究目的和意义

第二章 硫化物应激对单环刺蜢呼吸肠中SOD活性和ROS含量的影响

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 方法

2 结果

2．1 硫化物暴露下的单环刺蜢呼吸肠SOD活性

2．2 硫化物暴露下的单环刺蜢呼吸肠ROS含量

3 讨论

第三章 硫化物对单环刺蜢呼吸肠组织Caspase-3表达的影响

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 方法

2 结果

2．1 单环刺螠Caspase-3基因全长cDNA序列获得与生物信息学分析

2．2 单环刺螠Caspase-3蛋白原核表达与纯化

2．3 不同浓度硫化物应激下，单环刺螠呼吸肠组织Caspase-3蛋白表达

3 讨论

结论

参考文献

致谢

个人简历

发表与待发表学术论文