铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的分离与活性评价

摘要

目前，细菌耐药问题日益严重，使传统抗生素面临着失效的危险，直接威胁到人类的生命健康。因此，寻找新的靶点来开发新型抗菌药物具有重要意义。群体感应(Quorum sensing，QS)是指细菌通过感知菌群中信号分子的浓度变化，从而对周围环境做出自身调整以抵抗不利因素的行为。QS系统调控着致病菌的多种行为如生物被膜的形成及毒力因子的表达。铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）是一种常见的机会致病菌，它的耐药性及毒力使得治疗铜绿假单胞菌感染十分困难。P.aeruginosa的群体感应(QS)系统对其致病力及毒力的产生（如绿脓菌素、鼠李糖脂、弹性蛋白酶、swarming运动、生物被膜的形成等）具有重要调控作用。因此，干扰P.aeruginosa QS系统是削弱其毒力的一个发展策略。群体应抑制剂（Quorum sensing inhibitors，QSIs）能够降低P.aeruginosa毒力及致病力，同时不抑制细菌的生长，与传统抗生素相比不会对细菌的生存产生选择性压力，理论上不易产生细菌耐药性，为新型抗感染药物的研究提供了一条新的途径。
　　本实验室在前期工作中发现海洋真菌Aspergillus sp.SY012的发酵产物及中药厚朴的粗提物具有铜绿假单胞菌群体感应抑制活性。本文目的是从Aspergillussp.SY012的发酵产物及厚朴的粗提物中追踪分离群体感应抑制剂，并对其活性进行评价。
　　利用P.aeruginosa（QSIS-lasI）及P.aeruginosa（PQSI-pqsA）报告菌株追踪检测Aspergillus sp.SY012发酵粗提物的活性，采用硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱层析、HPLC对活性成分进行分离纯化，最终得到两个活性化合物，利用核磁共振波谱解析确定化合物结构分别为α-环匹阿尼酸及其同分异构体异α-环匹阿尼酸。数据分析表明，在亚抑菌浓度下，它们对P.aeruginosa PAOI的弹性蛋白酶活性、绿脓菌素及鼠李糖脂产量、swarming运动等毒力因子都具有显著抑制作用，并且可显著降低las、rhl及pqs系统相关基因转录水平的表达。利用大肠杆菌异源报告菌株E.coli MG4/pKDT17和E.coli pEAL08-2检测异α-环匹阿尼酸及α-环匹阿尼酸对las和pqs群体感应系统的作用，异α-环匹阿尼酸及α-环匹阿尼酸对于异源表达的las及pqs系统均有显著抑制作用，其中相同浓度的异α-环匹阿尼酸活性强于α-环匹阿尼酸。二者具有相同的平面结构，唯一不同就是5位C的立体结构，可能对化合物的QSI活性起到重要作用。
　　利用了P.aeruginosa（QSIS-lasI）报告菌株对中药厚朴的粗提物进行活性追踪及检测，得到明显的活性位点，采用生物自显影薄层色谱、制备薄层色谱和高效液相色谱技术分离到活性化合物，通过核磁共振波谱解析确定活性化合物为和厚朴酚。在亚抑菌浓度下，和厚朴酚能够抑制P.aeruginosa PAOI毒力因子的产生，包括swarming运动、绿脓菌素及鼠李糖脂产量，RT-PCR检测结果表明和厚朴酚对P.aeruginosa PAOI QS相关调控基因的mRNA表达水平有显著抑制作用。和厚朴酚(honokiol)是具有抗氧化，抗炎，抗焦虑，抗抑郁等多种生物活性的多酚，为厚朴的主要成分。和厚朴酚作为P.aeruginosa QSI，是它生物活性的又一新发现。
　　本文从Aspergillus sp.SY012的发酵产物及中药厚朴的粗提物中分离得到了铜绿假单胞菌群体感应抑制剂，并首次发现α-环匹阿尼酸、异α-环匹阿尼酸及和厚朴酚具有QSI活性，为QSI的结构改造和构效关系研究提供良好的前体化合物。本研究具有明确的应用前景和一定的理论意义。

目录

声明

摘要

0 前言

0．1．细菌耐药现状及研究背景

0．2．细菌群体感应系统

0．2．1 革兰氏阳性细菌群体感应系统

0．2．2 AI-2细菌种间群体感应系统

0．2．3 AI-3群体感应系统

0．2．4 革兰阴性菌群体感应系统

0．3 群体感应抑制因子的研究进展

0．3．1 针对QS信号分子合成过程的QSI

0．3．2 针对信号分子结构的QSI

0．3．3 针对信号分子受体的群体感应抑制剂

0．3．4 以铜绿假单胞菌QS为靶标开发群体感应抑制剂

0．4 本文的研究内容及意义

1．Aspergillus sp．SY012发酵产物中QSI的分离及活性检测

1．1 实验材料及仪器

1．1．1 实验材料及试剂

1．1．2 实验仪器

1．1．3．模型菌株

1．2 实验方法

1．2．1 发酵培养基的配置及灭菌

1．2．2 Aspergillus sp．SY012的发酵培养

1．2．3 Aspergillus sp．SY012发酵浸膏的制备

1．2．4 检测Aspergillus sp．SY012发酵产物的群体感应抑制活性

1．2．5．Aspergillus sp．SY012发酵粗提物中群体感应抑制剂的分离纯化

1．2．6 活性化合物结构鉴定

1．2．7．检测活性化合物对铜绿假单胞菌PAOI生长的影响及对毒力因子作用

1．2．8．在大肠杆菌中检测活性化合物对las及pqs系统的作用

1．2．9．实时荧光定量PCR检测铜绿假单胞菌QS相关基因的mRNA表达水平

1．3 实验结果

1．3．1 Aspergillus sp．SY012发酵浸膏的制备

1．3．2 初步检测Aspergillus sp．SY012发酵粗提物的群体感应抑制剂活性

1．3．3 追踪检测Aspergillus sp．SY012发酵粗提物的群体感应抑制活性

1．3．4 Aspergillus sp．SY012中群体感应抑制剂的活性追踪分离

1．3．5 12-1及12-2的结构

1．3．6 初步检测α-环匹阿尼酸及异α-环匹阿尼酸的活性

1．3．7 α-环匹阿尼酸及异α-环匹阿尼酸的QSI活性评价

1．4 讨论

2 中药厚朴中群体感应抑制剂的分离与活性评价

2．1 实验材料、试剂及仪器

2．1．1 实验材料及试剂

2．1．2 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1．中药材处理方法及粗提物的制备

2．2．2．中药粗提物QSI活性检测

2．2．3．铜绿假单菌毒力因子检测

2．2．4 铜绿假单胞菌Qs相关基因的mRNA检测

2．3 实验结果

2．3．1 厚朴中活性成分确定及活性评价

2．4 讨论

3．总结与展望

3．1 总结

3．2 展望

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果