骨髓间充质干细胞移植联合参芪通脉汤治疗大鼠后肢缺血的实验研究

摘要

目的：研究骨髓间充质干细胞(mesenchymal.stem cells，MSCs)的分离、体外培养、扩增的方法，对MSCs进行鉴定，观察骨髓干细胞的生物学特性。研究联合应用参芪通脉汤是否可以增强MSCs移植治疗大鼠后肢缺血的效果，并且探讨其可能的机制。 方法：使用骨髓腔冲洗法采集大鼠骨髓血，通过密度梯度离心结合贴壁筛选法得到纯化的MSCs，在含有10％胎牛血清的低糖DMEM培养液中继续培养扩增MSCs。通过细胞形态、贴壁生长特性、流式细胞仪检测细胞CD29、CD44、CD11b、CD45的表达，对培养的MSCs进行鉴定。观察MSCs的细胞形态、生长速度、绘制MSCs的生长曲线、测定MSCs克隆形成率，冻存复苏MSCs后观察其存活率和生长状态。观察DAPI标记MSCs的效率和对MSCs生长状态的影响。Wistar。大鼠24只，结扎右侧股动脉及其分支，制备成大鼠后肢动脉缺血模型，并随机分为3组，每组8只，分别是对照组、MsCs组和MSCs+中药组。股动脉结扎术后24h，MSCs组和MSCs+中药组大鼠给予含有MSCs(1×10<'7>cells)DMEM 0.4ml注射于患肢缺血肌肉组织中，对照组的大鼠仅注射DMEM中药+MSCs组大鼠于股动脉结扎术后24h开始口服参芪通脉汤制剂，每天早晚各一次，连续3周。股动脉结扎术后第22d，行激光多谱勒血流灌注成像(laser Doppler perfusion imaging，LDPI)检查患肢血流灌注恢复情况，免疫组织化学染色检查VEGF在组织中的表达。 结果：使用密度梯度离心结合贴壁筛选法可以得到高纯度的MSCs，MSCs可以通过体外培养大量扩增。通过本方法培养的MSCs贴壁生长，呈典型的梭形形状，漩涡状排列。流式细胞仪检测细胞表型CD29、CD44表达阳性，CD11b、CD45表达阴性，符合MSCs的特征。观察细胞生长特性发现：MSCs呈贴壁生长，原代培养9-12d可以达到90％融合，传代后的MSCs增殖速度较原代培养明显增快，第3代的MSCs已基本纯化。随着传代的增加，体外培养的MSCs生长增殖能力逐渐减弱，克隆形成率逐渐降低。冻存1个月和6个月后复苏的MSCs生存率分别为90％和85％，复苏后的细胞生长状态良好。DAPI标记MSCs的有效率为100％，标记48h后荧光显色无明显减弱，DAPI标记的MSCs的细胞形态和生长状态无明显变化。LDPI检查显示MSCs+中药组和MSCs组明显强于对照组(P<0.01)，MSCs+中药组最强，免疫组织化学染色和计算机图像分析显示MSCs+中药组较MSCs组和对照组VEGF蛋白表达更强(P<0.05)。 结论：密度梯度离心结合贴壁筛选法可以有效的获得纯化的MSCs，体外扩增MSCs是可行的。冻存对MSCs生长特性无明显影响。DAPI可以有效的标记MSCs细胞核，并且对MSCs的形态和生长状态无明显影响。应用MSCs+中药移植与MSCs组均可以促进血管新生、侧枝血管形成和增加缺血组织的血流灌注。联合应用参芪通脉汤可以明显增强MSCs移植治疗大鼠后肢缺血的效果。

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学特性观察

一、材料

(一)实验动物

(二)主要仪器

(三)主要试剂

(四)试剂的配置

二、实验方法

(一)密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞

(二)骨髓间充质干细胞的体外培养

(三)流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞细胞表型

(四)绘制骨髓间充质干细胞的生长曲线

(五)骨髓基质干细胞克隆形成率的检测

(六)DAPI标记的观察

(七)骨髓间充质干细胞的冻存

三、结果

(一)密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞

(二)骨髓间充质干细胞的原代培养

(二)骨髓间充质干细胞的传代培养

(四)流式细胞仪检测MSCs表型

(五)大鼠MSCs原代培养观察及传代MSCs生长曲线

(六)骨髓间充质干细胞克隆形成率

(七)DAPI标记骨髓间充质干细胞

(八)骨髓间充质干细胞冻存和复苏

四、讨论

(一)骨髓间充质干细胞的分离和培养方法

(二)骨髓间充质干细胞的生长特性

(三)骨髓间充质干细胞的鉴定

(四)骨髓间充质干细胞的标记

第二部分骨髓间充质干细胞移植联合参芪通脉汤治疗大鼠后肢缺血的实验研究

一、器材和试剂

二、实验动物

三、MSCs的分离和培养

四、大鼠后肢动脉缺血模型制作

五、实验动物分组及处理方法

六、检查指标

(一)激光多普勒血流灌注成像检测

(二)免疫组织化学检测VEGF

七、统计学方法

八、结果

(一)动物一般情况观察

(二)激光多普勒血流灌注成像检测

(三)免疫组化检测VEGF表达

九、讨论

(一)中医药促进血管新生的理论基础

(二)MSCs移植治疗大鼠后肢缺血的效果及其作用机理

(三)MSCs移植联合参芪通脉汤治疗大鼠后肢缺血的效果及其机制

结 语

参考文献

综 述 治疗性血管新生与下肢脉缺血性疾病的研究进展

附录

致 谢