“劳倦过度、房室不节”肾阳虚模型小鼠及其以药反证脑基因表达谱的研究

摘要

目的：本研究旨在利用基因芯片技术探讨“劳倦过度、房室不节”肾阳虚模型小鼠及其补肾中药金匮肾气丸、右归丸治疗后脑基因表达谱的改变，“以药反证”，并在分子水平上研究药物的作用机理，同时还比较二方剂作用的基因变化。 方法：对照组、造模组、金匮肾气丸组和右归丸组，各组雄性小鼠随机为10只、15只、10只和10只。四组均予正常喂养，对照组和造模组每天灌胃蒸馏水0．5mL/只，二治疗组每天分别灌胃金匮肾气丸混悬液0．5mL/只和右归丸混悬液0．5mL/只，造模组和二治疗组均采用雄雌鼠比例1：6同笼喂养和雄鼠每日游泳至无力下沉共4周，以诱导产生“劳倦过度、房室不节”肾阳虚证。用36K mouse genome array鼠脑芯片检测正常对照组和肾阳虚模型组鼠脑基因，并以二者荧光信号相对强度比值≥2和≤0．5筛选差异显著基因，并进一步查阅北京博奥生物分子注释系统，进行基因功能归类。为进一步验证芯片所检测的差异基因，还应用Real-Time PCR对部分差异显著基因进行检测验证。 结果：造模组诱导成功“劳倦过度、房室不节”肾阳虚鼠模型，同时通过基因芯片检测，分别绘制了造模组/对照组与二治疗组/造模组基因表达谱的散点图。造模组/对照组共筛选出186个差异表达基因，其中上调基因150个，下调基因36个。金匮肾气丸组/造模组筛选出299个差异表达基因，其中上调基因114个，下调基因185个。右归丸组/造模组筛选出155个差异表达基因，其中上调基因64个，下调基因91个。二治疗组/造模组基因均上调的基因24个，分别占各组上调基因的21．05%和37．50%，其主要是与神经传递/信号转导、转录/翻译、激素、细胞周期和代谢相关的基因；二治疗组均下调的有35个基因，分别占各组下调基因的18．92%和38．46%，其主要是与转录/翻译、神经传递/信号转导、炎症/免疫、代谢以及影响多巴胺生成的限速酶有关基因。造模组/对照组上调基因而治疗组/造模组基因下调的有23个基因，其主要是与炎症/免疫、神经传递/信号转导等相关基因；造模组/对照组下调基因而治疗组/造模组基因上调的基因有6个，其主要是与细胞周期/细胞结构、神经传递/信号转导、转录等有关基因。 结论：造模组上调基因主要涉及与炎症/免疫、氧化应激等有关基因，使得炎症/免疫和氧化反应增强，创伤、损伤反应和凝血机制增强，这些都是机体的保护性反应所致，还有多巴胺神经介质分泌减少引起多巴胺能神经紊乱。下调基因主要与激素（特别是黑色素浓集素和性激素）、细胞周期、信号转导/神经传递、代谢（特别是蛋白质代谢）和生长发育（特别是脑发育和精子发育、受精等）相关基因。金匮肾气丸、右归丸可使肾阳虚小鼠模型显著下调的激素、黑色素浓集素显著上调并促进细胞增殖，从而在基因水平上探讨了金匮肾气丸和右归丸的药物作用机理及其差别。

目录

文摘

英文文摘

声明

引　言

材料与方法

1.1模型制作

1.1.1造模材料

1.1.2造模方法

1.2脑组织总RNA提取

1.3对样品RNA进行荧光标记

1.3.1所用36K mouse genome array芯片

1.3.2双链cDNA合成

1.3.3体外转录合成cRNA

1.3.4随机引物反转录

1.3.5 cDNA用KLENOW酶标记

1.4杂交与清洗

1.5芯片扫描

1.6芯片图像的采集与数据分析

1.7差异表达基因的功能归类

1.8 Realtime RT-PCR

1.8.1 RNA逆转录

1.8.2 Real-Time PCR反应

1.9聚类分析

2.结果

2.1动物的一般表现

2.2鼠脑组织的RNA提取分析

2.3差异表达基因分析

2.3.1差异表达基因的功能分布及其调控路径

2.3.2造模组／对照组差异表达基因

2.3.3金匮肾气丸组／造模组差异表达基因

2.3.4右归丸组／造模组差异表达基因

2.3.5金匮肾气丸组／造模组与右归丸组／造模组差异表达基因的比较

2.3.6“以药反证”差异表达基因

2.3.7 Realtime RT-PCR检测

2.3.8各组基因比值的聚类分析

3.讨 论

3.1肾阳虚证及其现代研究

3.1.1肾阳虚证动物模型的研究

3.1.2肾阳虚证的临床表现及分型

3.1.3肾阳虚证临床及实验研究

3.2“劳倦过度、房室不节”肾阳虚小鼠模型脑的差异基因表达

3.3金匮肾气丸对“劳倦过度、房室不节”肾阳虚小鼠模型影响的脑差异基因表达

3.4右归丸对“劳倦过度、房室不节”肾阳虚小鼠模型影响的脑差异基因表达

3.5金匮肾气丸、右归丸对肾阳虚小鼠模型影响的脑差异基因表达的比较

3.6金匮肾气丸和右归丸对肾阳虚小鼠模型“以药反证”差异表达基因图谱

3.7聚类分析

结语

参考文献

肾阳虚证及其“以药测证”的基因芯片研究进展

附 录

致谢

科技查新报告

山东省研究生优秀科技创新成果奖证书