舒郁胶囊对抑郁症肝气郁结证模型大鼠海马作用靶点基因筛选及5-HT受体相关基因差异表达的验证

摘要

目的:用基因芯片检测抑郁症肝气郁结证模型大鼠海马内5-HT受体相关基因的表达变化,初步探讨抑郁症肝气郁结证对海马内5-HT受体的作用机制,并研究调肝方药舒郁胶囊和柴胡皂苷对该病证的干预作用。
　　方法:旷场试验筛选大鼠,采用慢性温和应激法(CMS)复制抑郁症肝气郁结证大鼠模型,模型评价采用糖水偏好实验、旷场试验等。以西药氟西汀为阳性药,并用调肝方药舒郁胶囊和柴胡皂苷进行干预。采用基因芯片检测大鼠海马内差异基因表达情况,比较模型组大鼠、正常组大鼠、舒郁胶囊干预组大鼠、柴胡皂苷干预组大鼠与氟西汀干预组大鼠之间的差异表达基因;用实时荧光定量PCR技术验证5-HT受体相关基因差异表达结果的可靠性。
　　结果:造模刺激4周后,与正常组相比,模型组旷场实验得分有显著性减少(P＜0.01)。与模型组相比,舒郁组、氟西汀组和柴胡组的得分均有显著性增加(P＜0.01,P＜0.001,P＜0.05),但三组之间比较没有显著性差异(P＞0.05)。模型组大鼠糖水摄入量较正常组、舒郁组及氟西汀组显著降低(P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01),说明抑郁症肝气郁结证模型成功,而舒郁胶囊和氟西汀能明显对抗抑郁大鼠糖水摄入量的减少,但两者之间没有显著性差异(P＞0.05)。柴胡皂苷不能明显改善抑郁大鼠糖水摄入量的减少,但也有一定的作用趋势。采用含有41000个己知基因的大鼠全基因组芯片检测大鼠海马内差异基因表达情况,结果显示模型组、正常组、舒郁组、柴胡组与氟西汀组之间的Htr1a, Htr5b, Htr2c,Htr3a基因存在差异表达。实时荧光定量PCR方法分别检测了Htr1a, Htr5b,Htr2c, Htr3a的表达情况,检测结果与基因芯片的结果基本一致,验证了4个目的基因结果的可靠性。
　　结论:采用CMS法可以成功制备抑郁症肝气郁结证大鼠模型,糖水偏好实验、旷场试验均可评价模型的有效性。各组大鼠海马中Htr1a, Htr5b, Htr2c, Htr3a差异表达,可能是抑郁症肝气郁结证发病的中枢机制之一;中药舒郁胶囊和柴胡皂苷可以有效纠正上述基因表达异常的状态,可能是药物治疗该病症的机制之一。

目录

摘要

Abstract

引言

实验一：抑郁症肝气郁结证大鼠模型的制备及宏观评价方法

1 实验材料

1.1 实验动物

1.2 药品及试剂

1.3 仪器及器材

2 实验方法

2.1 实验动物分组

2.2 给药剂量

2.3 慢性温和应激（CMS）造模方法

2.4 行为学实验

2.5 大鼠脑组织取材

2.6 统计方法

3 实验结果

3.1 各组大鼠糖水偏好值比较

3.2 各组大鼠旷场实验行为学得分比较

3.3 大鼠宏观表现观察

实验二 利用基因芯片检测抑郁症肝气郁结证模型大鼠海马的差异表达基因

1 实验材料

2 实验方法

2.1 实验组织的保存与运输

2.2 样品 RNA 抽提

2.3 RNA 质量检测

2.4 aRNA 样品合成和标记

2.5 标记效率质量检测

2.6 芯片杂交与清洗

2.7 芯片扫描

2.8 芯片图像的采集

2.9 数据分析

3 实验结果

3.1 总 RNA 质量检测

3.2 基因芯片扫描结果

3.3 箱式图（Box plot）分析

3.4 聚类分析(cluster analysis)

3.5 差异基因比较分析散点图（Scatter Plot）

3.6 差异表达基因筛选

3.7 基因功能聚类分析

3.8 5-HT 受体基因差异表达相关信息

实验三 实时荧光定量 PCR 验证 5-HT 相关差异表达基因

1 实验材料

1.1 实验样品

1.2 实验试剂

1.3 实验仪器

1.4 引物及探针设计

2 实验方法

2.1 样品总 RNA 的提取

2.2 总 RNA 的测定

2.3 模板 cDNA 的合成

2.4 实时定量 PCR 验证基因表达

2.5 数据分析

3 实验结果

3.1 实时定量 PCR 扩增曲线

3.2 各组海马组织中目的基因表达的比较

3.3 荧光定量 PCR 结果和基因芯片结果的对比

讨论

1 慢性温和应激法制备抑郁症肝气郁结证大鼠模型

2 抑郁症肝气郁结证大鼠模型的评价

2.1 糖水偏好实验结果分析

2.2 旷场实验和宏观行为药理学结果分析

3 5-羟色胺(5-HT)受体在抑郁症中的研究概况

3.1 Htr1a 与抑郁症的关系

3.2 Htr2c 与抑郁症的关系

3.3 Htr3a 与抑郁症的关系

3.4 Htr5b 受体与抑郁症的关系

4 舒郁胶囊及柴胡皂苷对抑郁症的作用

4.1 舒郁胶囊

4.2 柴胡皂苷的现代药理学研究

5 用基因芯片研究抑郁症肝气郁证的思考

6 用基因芯片研究中药单体及复方作用的思考

7 基因芯片结果验证的必要性

8 Taqman 探针实时定量 PCR 技术在应用中的优势

问题与展望

结语

参考文献

综述

参考文献

附录：缩写词表

致谢