青海湖裸鲤钙调蛋白磷酸酶(Calcineurin,CN)的克隆、表达、和功能研究

摘要

青海湖裸鲤是分布于青海湖及其周边流域的唯一的经济鱼类,在鱼-鸟-草地生态系统中处于核心地位。开展青海湖裸鲤基础生物学特征和适应低氧、低温、高盐度的分子机理的研究,有助于揭示青海湖裸鲤的基本生命活动规律,为该鱼种的资源保护和人工增殖放流提供理论依据。
　　为了在基因功能研究中得到可靠地内参基因,通过RT-PCR和RACE方法得到了青海湖裸鲤三磷酸甘油醛脱氢酶(Gp-GAPDH)基因两种异形体的完整编码序列,分别命名为Gp-GAPDHα(JX287372)和Gp-GAPDHβ(JX287373),同时对于Gp-GAPDHα和Gp-GAPDHβ在不同的组织和受精卵发育不同阶段的表达量进行研究,发现Gp-GAPDHα与Gp-GAPDHβ在青海湖裸鲤不同组织和受精卵发育不同阶段表达量存在较大差异,尤其Gp-GAPDHβ在受精卵发育不同阶段差异显著。初步断定Gp-GAPDHβ不适合作为参照基因,而Gp-GAPDHα表达稳定性需要进一步研究,选择其作为参照基因需谨慎。
　　钙调蛋白磷酸酶(CN),是由催化亚基(CN A)和调节亚基(CN B)组成的异二聚体的蛋白酶,它在多项生理过程中发挥重要作用,是一个多功能的信号酶,它可被Ca2+和钙调蛋白所激活。从青海湖裸鲤鳃组织通过RT-PCR和RACE方法克隆得到了CNA的两个旁系同源体(GpCAα and GpCAγ)基因序列以及CNB序列,通过real time方法研究了其在胚胎发育不同阶段和盐度适应过程中的表达模式,同时通过免疫组化方法确定了其在肾脏、心脏、脑子、精巢和鳃等不同组织中的分布特征。结果发现,青海湖裸鲤卵细胞受精后,GpCAα、GpCAγ和GpCB三种基因都在胚胎发育中持续性表达,同时表现为先降后升的趋势,GpCAα和GpCB在神经胚期表达量达到最小,相比之下,GpCAγ则在原肠胚期表达量最少。在盐度的适应过程中,GpCAα和GpCAγ表达量随着盐度的逐渐升高而升高,而GpCB表达量在胁迫初期升高之后却有下降的趋势。通过免疫组织化学方法确定了CN在青海湖裸鲤肾、心脏、脑子、精巢和鳃丝中特殊位置存在表达。
　　通过此次研究可以推测,CN在青海湖裸鲤胚胎发育、盐度胁迫适应过程及各组织功能维持中起着重要的作用。研究结果为进一步了解CN的作用及其机理提供了基本资料,同时为青海湖裸鲤的增殖放流工作起着指导作用。

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第1章 引言

1.1 青海湖裸鲤研究概述

1.1.1 青海湖裸鲤人工繁殖的研究

1.1.2 青海湖裸鲤生理学研究

1.1.3 青海湖裸鲤分子生物学和细胞生物学研究

1.1.4 青海湖裸鲤营养学研究

1.2 钙调蛋白磷酸酶（Calcineurin）概述

1.2.1 CN的结构、分布和功能

1.2.2 CN参与信号途径

第2章 青海湖裸鲤GAPDH克隆和表达特性研究

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 总RNA 的提取和GAPDH基因末端模板制备

2.2.2 Gp-GAPDH基因特异性片段的扩增

2.2.3 Gp-GAPDHα基因全长扩增

2.2.4 Gp-GAPDHβ基因全长扩增

2.2.5 Gp-GAPDH基因序列分析

2.2.6 GAPDH基因在青海湖裸鲤不同组织中的表达水平检测

2.2.7 GAPDH基因在青海湖裸鲤受精卵不同发育阶段的表达水平检测

2.2.8 统计分析与绘图

2.3 结果

2.3.1 Gp-GAPDHα与Gp-GAPDHβ的克隆与序列分析

2.3.2 序列分析

2.3.3 GAPDH表达模式的研究

2.4 讨论

第3章 钙调蛋白磷酸酶(CN)的克隆、鉴定和功能分析

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验动物与材料

3.2.2 青海湖裸鲤各组织总RNA的提取及第一链cDNA合成

3.2.3 CN大小亚基基因片段的克隆

3.2.4 快速扩增（RACE）cDNAs末端模板制备

3.2.5 CN大小亚基末端片段的扩增

3.2.6 CN大小亚基基因全长验证

3.2.7 Real time PCR测定CN大小亚基在胚胎不同发育阶段及盐度胁迫过程中表达模式

3.2.8 CN大小亚基表达载体的构建和原核表达

3.2.9 CN大小亚基融合蛋白纯化与多克隆抗体制备

3.2.10 免疫组化方法对CN大亚基不同组织中表达进行定位分析

3.3 结果

3.3.1不同组织总RNA的制备

3.3.2 CN大小亚基基因的克隆

3.3.3 CN大小亚基基因的序列分析

3.3.4 CN大小亚基在胚胎发育不同阶段表达模式

3.3.5 CN大小亚基在不同盐度胁迫条件下的表达模式

3.3.6 CN大小亚基的原核表达

3.3.7 CN大亚基在不同组织中的定位

3.4 讨论

3.4.1 CN大小亚基基因克隆

3.4.2 CN大小亚基表达模式的研究

3.4.3 CN大小亚基不同组织中定位的研究

参考文献

致谢

简历