一种用于青海湖裸鲤肠道单细胞水平NKA蛋白染色的方法

摘要

本发明涉及一种用于青海湖裸鲤肠道单细胞水平NKA蛋白染色的方法，包括取组织、酶解、制备肠道单细胞悬液、NKA染色。本发明能够实现低成本、快速、高效获得青海湖裸鲤肠道单细胞悬液，并保证解离的细胞保持良好活力，可应用于为其他鱼类细胞的解离、分离纯化以及细胞系的建立，为青海湖裸鲤的单细胞、基因功能研究提供重要参考资料。

说明书

技术领域

本发明属于鱼类细胞生物学领域，特别涉及一种用于青海湖裸鲤肠道单细胞水平NKA蛋白染色的方法。

背景技术

青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)俗称湟鱼，属鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)，裸鲤属(Gymnocypris)，是青海湖中重要的经济鱼类，在青海湖生态系统中占据核心地位。青海湖裸鲤是溯河性产卵鱼类，性成熟裸鲤每年4-7月从青海湖溯游到淡水支流泉吉河和布哈河等河道，完成产卵繁殖后，亲鱼及孵化后的幼体再洄游到青海湖。青海湖盐度13～15，碱度26～32mmol/L，pH 9.1～9.5，且由于蒸发和灌溉等因素，湖水碱度逐年升高。生活在湖水中的裸鲤因具有耐盐碱、耐高寒等优良特性而受到关注。研究表明，青海湖裸鲤由淡水过渡到高盐碱湖水的过程中，其呼吸、排泄、免疫及能量代谢等生理生化活动会发生显著变化，通过体内调节来适应盐碱环境。

绝大多数水生生物对水环境中的盐碱度变化较为敏感，高盐度影响水生生物的渗透平衡，高碱度导致水生生物的组织功能损伤、消化酶及免疫相关酶活性下降，且盐度、碱度和pH在对水生生物的生长繁殖、代谢等方面的影响表现出一定的协同作用。目前，有关鱼类鳃和肾在渗透和酸碱调节方面的作用已有较为深入的研究，而最近的研究发现肠道在维持渗透和酸碱平衡中也发挥着重要作用。

鱼类肠上皮细胞类型和功能复杂，除了参与渗透调节的细胞外，还有消化相关细胞、免疫相关细胞、内分泌相关细胞以及呼吸相关细胞。如果分辨和分离出渗透和酸碱平衡相关细胞，对于研究此类细胞的调控机制至关重要。由于Na

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于青海湖裸鲤肠道单细胞水平NKA蛋白染色的方法，该方法有助于快速、高效解离青海湖裸鲤肠道单细胞，制备高质量的单细胞悬液，进而通过NKA抗原抗体免疫反应进行染色，对于鱼类细胞的解离、分离纯化以及渗透调节阳性细胞的筛选具有重要的应用价值。

本发明提供了一种用于青海湖裸鲤肠道单细胞水平NKA蛋白染色的方法，包括：

(1)取青海湖裸鲤肠道新鲜组织，冲洗，然后放入含D-PBS缓冲液的离心管中离心，随后加入肠道组织消化酶混合液酶解消化，得到组织消化液；

(2)将步骤(1)得到的组织消化液过滤、离心、重悬，得到肠道单细胞悬液；

(3)将步骤(2)得到的肠道单细胞悬液滴加到载玻片上，待沉降吸走细胞悬液，随后固定、封闭肠道单细胞，分别加入NKA一抗、二抗染色，最后荧光显微镜拍照即可。

所述步骤(1)中的D-PBS缓冲液不包含钙离子、镁离子和酚红。

所述步骤(1)中的肠道组织消化酶混合液组成为：0.1-0.5mg/ml胶原酶Ⅰ、0.04-0.08mg/ml胶原酶Ⅱ和0.1-0.5mg/ml胶原酶Ⅳ，溶剂为D-PBS缓冲液。

所述步骤(1)中的酶解消化时间为15-30min。

所述步骤(2)中的重悬采用预冷的D-PBS缓冲液，D-PBS缓冲液中还包含2％胎牛血清(FBS)。

所述步骤(3)中的NKA一抗抗体稀释比为1:100，NKA二抗抗体稀释比为1:400。

本发明采用的肠道组织消化酶混合液组成为胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅳ。在传统的哺乳动物组织单细胞消化过程中消化酶混合液普遍添加胰酶。经反复实验得出，在本发明中消化酶混合液不能添加胰酶，原因是胰酶为烈性酶，在消化过程中易导致裸鲤肠上皮细胞破裂，释放出DNA胶联而形成胶状物，细胞活力不强且不易过细胞筛。而使用胶原酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ混合液在消化过程中不存在上述问题，且细胞活力满足后续实验要求。

裸鲤肠道组织的细胞结构是由蛋白质(如胶原蛋白)、糖蛋白、脂质、糖脂和粘多糖等复杂基质构成的。为了分离单个细胞，必须非常小心地消化这种复杂的基质，而不会对细胞表面或细胞内结构造成不可逆转的损伤。胶原酶I和II对天然胶原蛋白和合成底物的特异性以及相对活性不同，胶原酶I作用是裂解长的未变性的胶原蛋白的三条螺旋链中的两条，胶原酶II是通过切割短合成肽发挥作用，胶原酶IV则能够限制对NKA等膜蛋白的损害。三种胶原酶混合使用才能够消化肠道组织不同蛋白质结构，同时保护NKA等膜蛋白的完整性。

在肠道组织消化过程中，消化时间的长短不同获得的细胞类型数量差别很大，本发明目的是获得用于渗透调节的细胞，酶解消化时间为15-30min。NKA是长期实验筛选获得的具有渗透调节的细胞标记物(图3)。

本发明能够实现低成本、快速、高效获得青海湖裸鲤肠道单细胞悬液，并保证解离的细胞保持良好活力，可应用于为其他鱼类细胞的解离、分离纯化以及细胞系的建立，为青海湖裸鲤的单细胞、基因功能研究提供重要参考资料。

附图说明

图1为实施例1的染色结果(20倍物镜)；其中，发亮点即为NKA蛋白分布位置。

图2为实施例1解离的青海湖裸鲤肠道单细胞活力测试结果。

图3为渗透调节细胞标记蛋白筛选。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

步骤一，解剖青海湖裸鲤，切取中肠组织放入含有预冷D-PBS缓冲液的无菌培养皿中，用解剖剪将肠道剖开，清洗组织；

步骤二，将组织清洗干净后，转入含有酶混合液(2mL)的内壁光滑离心管中,将组织剪成1-2mm

步骤三，消化期间每5min上下颠倒混匀一次，消化至组织块基本消失；

步骤四，将组织消化液用40μm细胞筛过滤后转入新的内壁光滑离心管中；

步骤五，将步骤四的溶液在4℃条件下300g离心5min，去掉上清液；

步骤六，将步骤五中的细胞沉淀加入预冷的D-PBS缓冲液，用移液器轻轻吹打重悬细胞，将细胞悬液在4℃条件下300g离心5min；

步骤七，重复步骤六2-3次，收集细胞沉淀物，并加入预冷的D-PBS缓冲液(包含2％胎牛血清FBS)，轻轻打吹3-5次重悬细胞，完成肠道单细胞悬液制备；

步骤八，取多聚赖氨酸载玻片，使用疏水记号笔画好实验区域；

步骤九，取适量单细胞悬液滴加在载玻片实验区域中，让活细胞自由沉降，随时在光学显微镜下检查细胞沉降情况；

步骤十，待细胞沉降密度适中的时候，吸走细胞悬液，立即使用D-PBS洗涤载玻片，洗涤3次，加/吸D-PBS尽量轻；

步骤十一，使用4％多聚甲醛固定载玻片上细胞10min，D-PBS洗涤3次；

步骤十二，使用3％BSA封闭液封闭细胞60min；

步骤十三，孵育NKA(SC-28800,Santa Cruz Biotechnology)一抗(抗体稀释比为1:100)，4℃过夜；D-PBS洗涤一抗3次；

步骤十四，使用3％BSA封闭液再次封闭载玻片60min；

步骤十五，孵育二抗(A11036,Thermo Fisher Scientific)(抗体稀释比为1:400)，室温1h；D-PBS洗涤二抗3次；

步骤十六，Hochest孵育30min；

步骤十七，荧光显微镜拍照，见图1。

本发明的方法能够实现低成本、快速、高效获得青海湖裸鲤肠道单细胞悬液，并保证解离的细胞保持良好活力，细胞活力在73％左右，见图2。