基于药物重定位的宿主靶向抗腺病毒药物发现

摘要

目的： 发现潜在抗腺病毒宿主靶标及具有抗腺病毒活性的药物。 方法： 1．抗腺病毒药物重定位预测：（1）基于关联网络的方法：从病原体感染关键宿主因子数据库（database and analysis resource of essential host，EHFPI）、病毒—宿主蛋白相互作用数据库（VirHostNet）中获得腺病毒-宿主靶标关系，从DrugBank数据库、HIT（Herbal Ingredients&Targets）数据库中获得药物（已上市药物及天然药物成分）—靶标关系，基于共用靶标的原则建立腺病毒—药物关联网络预测可能药物。（2）基于转录组表达谱分析的方法：通过转录组测序技术（RNA-seq）建立腺病毒感染人肺小细胞腺癌细胞（A549）不同时间节点转录组表达谱，通过预测差异表达基因的上游调控因子辨识病毒感染过程中的关键宿主因子并发现可能的药物靶标。（3）基于表达谱印记的方法：将腺病毒感染转录组表达谱与细胞反应印记整合图书馆(Library of Integrated Network-based Cellular Signatures，LINCS)数据库中药物扰动表达谱进行比对，采用表达谱印记算法预测具有抗腺病毒活性的已上市药物。 2．宿主靶标验证：采用基因高表达和基因沉默技术验证辨识的关键宿主因子与腺病毒复制的关系。 3．活性评价：（1）体外：采用病毒致细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）抑制实验对预测获得的药物进行活性初筛；采用空斑减数实验、测定病毒DNA拷贝数实验在多种细胞上对目标药物进行系统的体外活性评价，并探讨可能的作用机制。（2）体内：尝试建立并可行的腺病毒感染动物模型，进一步对目标药物进行体内药效评价。 结果： 1．基于关联网络方法筛选出处于Ⅱ期临床试验的抗肿瘤药物Roscovitine具有抗腺病毒活性，抑制5型、7型、55型腺病毒感染性病毒滴度的半数有效浓度（50%inhibitory concentration，IC50）分别为4.36μM、6.49μM、3.93μM，活性优于阳性药西多福韦（Cidofovir）。以Roscovitine为母核结构优化的四种Roscovitine衍生物抑制HAdV病毒滴度的IC50均在2μM左右。 2．对转录组表达谱的分析结果表明腺病毒感染能够引起宿主细胞发生与机体损伤、肿瘤发生、细胞周期调控、免疫反应、凝血、血管生成等功能相关的反应变化。 3．通过上游调节因子预测及实验验证辨识出病毒感染过程中可能起关键作用的五个宿主因子：CD24、PIMI、MAP3K14、RARB和NEDD9。其中，RARB基因编码的视黄酸β受体（RARβ）蛋白与腺病毒复制存在密切关系：RARβ蛋白低表达可促进腺病毒复制；RARβ蛋白高表达可抑制腺病毒复制，RARβ可能是潜在的抑制腺病毒复制的宿主靶标。同时，类RARβ激动剂药物Tazarotene具有体外抑制腺病毒复制的作用，进一步的研究结果表明该药物对HAdV复制周期的影响发生在早期蛋白E1A表达之后病毒自身复制的阶段。 4．基于表达谱印记方法预测并筛选出治疗2型糖尿病的药物罗格列酮具有良好的体外抗腺病毒活性。该药物能够通过直接激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor,PPARγ），并在过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated re-ceptor gamma coactivator-1α,PGC-1α）的协同作用下促进信号传导及转录激活因子1（Signal transducers and activators of transcription，STAT1）蛋白的磷酸化，进一步结合干扰素调节因子9（interferon response factor9，IRF9）蛋白并诱导激活了I型干扰素信号通路来发挥抑制HAdV复制活性。因此，药物罗格列酮可成功重定位于抗腺病毒作用。 5．建立了5型腺病毒感染重症联合免疫缺陷（severe combinedimmunedeficiency，SCID）小鼠模型。一方面，该模型小鼠表现出严重的肺组织病变并涉及到体内多种炎症细胞因子的异常改变；另一方面，病毒DNA在小鼠肺、肝、肾多组织中均有所增殖；感染8天后的小鼠肺组织中仍可维持较高的感染性病毒滴度。应用该模型对罗格列酮进行了体内药效评价，结果表明罗格利酮25mg/kg/d治疗给药后体现出了显著抑制腺病毒病毒滴度作用，并能够减轻感染所导致的肺组织病理改变。 结论： 本研究基于药物重定位策略，结合高通量测序技术获得的腺病毒感染宿主细胞转录组数据及已有的多个知识型数据库，采取多角度、不同的分析方法从已上市药物中筛选得到三个具有抗腺病毒活性的药物Roscovitine、Tazarotene和Rosiglitazone，其中，Roscovitine的四种衍生物也具有显著的抗腺病毒活性，为开发新型抗腺病毒药物提供了候选结构。同时，发现一个具有抑制腺病毒复制的潜在宿主靶标RARβ。本研究为开发抗HAdV药物提供了丰富的线索和理论支持。

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