花生（Arachis hypogaea L.）未成熟种子cDNA文库的构建与花生Arachin基因cDNA克隆的初步筛选

摘要

花生的贮藏蛋白虽然为人类提供必需氨基酸,但是有些类型的贮藏蛋白是过敏原,研究其贮藏蛋白基因的结构、功能及其调控具有双重意义,而基因的克隆是进行上述研究的前提,为此,开展了该项研究.该工作通过异硫氰酸胍改进法分离了花生未成熟种子的总RNA,紫外分光光度计测得OD<,260>/OD<,280>的比值为1.98,电泳检测显示18S、28S rRNA条带清晰,且28S亮度明显大于18S.以oligo(dT)为引物合成cDNA第一条链,随后以链置换法合成cDNA双链.经同位素标记放射自显影显示:两条链最长可达5kb.在双链cDNA两端加接头,与载体λgtl0连接,体外包装后导入大肠杆菌生成cDNA文库.未扩增文库含有3× l0<'6>个独立的噬菌体克隆,扩增后滴度为8×10<'10>pfu/ml,重组率为91﹪.随机挑取26个克隆,PCR检测插入片段长度平均为1.2kb.随机取两个PCR产物测序,其中一个是未知基因,另一个为豌豆肌动蛋白基因的同源序列.