花生基因组噬菌体文库的构建及种子贮藏蛋白Arachin基因上游序列的克隆

摘要

外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。 目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。 在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。基因表达的空间性和暂时性的调控是发育和形态的基础，种子贮藏蛋白基因在种子内严格的种子特异性和依赖发育过程的表达调控为研究植物分化基因的活性提供了一个合适的实验系统。种子贮藏蛋白的种子特异性调控首先在转录水平上，过量转录可以调整翻译产物的最终的量。目前认为特异的反式转录因子和顺式转录因子与靶DNA序列结合是最重要的调控机制，已经证实几种来源于不同种子蛋白基因5'侧翼区的DNA片段与已知的核酸蛋白因子结合，然而大多数并没有得到很好的阐述。已从几个物种中克隆出来的贮藏蛋白基因的5'侧翼区序列，可能推动对于种子贮藏蛋白保守区的研究，保守区可能参与了反式作用因子的结合从而对基因在种子内特异表达进行调控。 花生种子贮藏蛋白基因Arachin是在种子内特异高效表达的基因，推测其启动子可以调控基因在种子内特异高效表达，因此对于该启动子的研究具有很大的意义。 本实验拟应用噬菌体原位杂交的方法筛选花生种子贮藏蛋白基因Arachin的启动子序列。用CTAB的方法提取了花生黄花苗的基因组DNA，进行部分酶切，以lambdaGEM-11噬菌体为载体构建了花生基因组噬菌体文库。对噬菌体文库进行滴度检测，构建的文库符合要求。 TAIL-PCR是一种扩增已知DNA片段侧翼序列的方法，利用已知的Arachin基因的cDNA序列设计引物，扩增出该基因在基因组中包含内含子的部分序列，根掘该段序列设计嵌套引物，进行TAIL-PCR，得到Arachin基因的部分上游序列，Blast分析证实该部分上游序列为Arachin基因的线性上游序列。对该序列进行了初步的启动子分析，发现没有启动子的保守序列，推测是长距离调控的启动子。

目录

独创声明及学位论文版权使用授权书

摘要

第一部分：文献综述

第二部分：实验论文

参考文献：

附录

致谢