鸡艾美耳球虫不同种株ITS-1、ITS-2序列的克隆和分析比较

摘要

球虫病是一种严重危害畜牧业、造成重大经济损失的寄生原虫病.长期以来,球虫的分类和鉴定主要依赖于卵囊和孢子囊的形态特征、寄生部位、最短潜在期、最短孢子化时间、致病性等生物学特征.随着分子生物学技术的发展,采用PCR方法对寄生虫某段具有种特异性的DNA序列进行分析开辟了寄生虫分类学研究的新纪元.内转录间隔区(Internal transcribed spacers,ITS)是一种广泛应用于寄生虫种间分类鉴定的理想遗传标记. 本论文利用单卵囊分离技术成功地分离到5株鸡艾美耳球虫纯株,其中第14＃虫株,其卵囊大小为22.25μm×17.38μm,卵囊形状指数为1.28;最短孢子化时间为16h;最短潜在期为81h;寄生部位为小肠前1/3部位,初步鉴定为早熟艾美耳球虫(Eimeria praecox),为开展该种球虫生物学、分子生物学研究提供了条件. 利用属特异性引物,对4种鸡艾美耳球虫基因组DNA进行PCR扩增,获得了4个虫种的ITS-1、ITS-2序列,大小范围在350bp-668bp之间,其中柔嫩艾美耳球虫(Etenella)的ITS-1序列大小为668bp,ITS-2序列为550-551bp;堆型艾美耳球虫(EacervuHna)的ITS-1大小为508bp,ITS-2为406bp;和缓艾美耳球虫(Emitis)的ITS-1大小为493bp,ITS-2为446bp;巨型艾美耳球虫(E.maxima)的ITS1有2条扩增条带,其大小分别约为550bp和426bp,ITS-2大小为350bp.根据各种艾美耳球虫ITS-1、ITS-2扩增片段数及扩增片段大小,完全可以对上述4种球虫进行鉴定和区分.将扩增产物克隆到pMD 18-T载体,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,进行序列测定,选用Etenella敏感株.ITS-1、ITS-2序列,与其它三种球虫的ITS-1、ITS-2序列进行同源性比对,结果发现,4种艾美耳球虫种间的ITS-1序列同源性为4l-3﹪-51.2﹪,ITS-2序列同源性为18.4﹪-31.6﹪,差异非常显著,完全可以利用两段ITS序列进行种间区分和鉴别. 利用PCR技术成功地扩增出了E.tenella抗药性表型不同的7个虫株的ITS-1、ITS-2序列,结果所有虫株的ITS-1大小均为668bp,ITS-2序列中,仅马杜拉霉素抗药株为550bp,其余虫株均为551bp.对Etenella虫株间序列同源性进行比对,发现ITS-1序列同源性为98.5﹪-99.9﹪,ITS-2序列同源性为96.2﹪-99.6﹪,各株间均有一些核苷酸差异,利用这些差异,有望采用一些特定的方法,对虫株进行区分和鉴别. 上述工作的开展,丰富了鸡球虫内转录间隔区序列的遗传资料,对于准确鉴定球虫虫种及具有不同表型特征的虫株、对球虫抗药性的产生机制和分子检测,对开展球虫分子流行病学调查、正确制定防治方案,有效地预防和治疗球虫病,具有重要的理论和经济意义.

目录

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综述一：ITS序列及其在寄生虫分类中的应用

综述二 鸡球虫抗药株遗传学变异和蛋白质差异表达研究进展

符号说明

第1章 早熟艾美耳球虫纯种的分离和初步鉴定

1材料与方法

1.1球虫混合田间分离物

1.2实验动物

1.3主要仪器

1.4实验方法

2实验结果

2.1单卵囊分离结果

2.214#单卵囊分离纯株生物学性状测定

3讨论

第2章 鸡艾美耳球虫不同种株ITS-1、ITS-2序列的克隆和分析比较

1材料和方法

1.1材料

1.2实验方法

2结果

2.1卵囊的繁殖和纯化

2.2PCR扩增

2.3PCR扩增产物胶回收

2.4重组质粒的鉴定

2.5序列测定结果分析

3讨论

3.1关于ITS序列用于球虫种、株间鉴定

3.2关于球虫卵囊的分离和纯化

3.3由PAUP4.0软件分析结果引起的思考

第3章：小结

参考文献

读硕士期间发表的论文

致谢