应用微卫星DNA对Holstein奶牛进行亲子鉴定

摘要

本实验的目的在于通过使用微卫星DNA检测荷斯坦牛的遗传多态性，进而建立一种适用于牛的亲子鉴定体系。 微卫星DNA(又称短串联重复序列，或简单重复序列)是以1～6bp的短核苷酸为基本单位，首尾相连组成的串联重复序列。大多数重复单位是二核苷酸，也有少量含有1、3至6个核苷酸的重复单位，重复次数一般在5次以上，可高达100次，片段长度通常在400bp以下。微卫星DNA由其核心序列和两侧的侧翼序列构成，侧翼序列使某一微卫星特异定位在染色体的一定位置，核心序列重复数的不同是构成微卫星多态性的基础。大于10次重复的微卫星DNA序列具有高度的种属多态性，从植物到脊椎动物这种多态性有很大的差别。正是由于微卫星DNA序列具有长度多态性的特点，它可用来对动物进行亲子鉴定。 本文选用联合国粮农组织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG)联合推荐的用于牛遗传分析的12个微卫星基因座，利用PCR和聚丙烯酰胺电泳银染技术对来自不同牛场的100头荷斯坦牛进行了遗传多态性检测。12个STR基因座的杂合度、多态信息含量、有效等位基因数的均值为0.8711、0.8574、8.1666，这些基因座的遗传杂合度及多态信息含量高，均为高度多态位点，12个STR的累积非父排除概率为98.999999％，适用于动物的遗传分析和个体鉴定。 应用这12个微卫星基因座对三种不同情况的36头不同家系的荷斯坦牛进行了亲子鉴定：第一种情况是给定父母双方与子代，排除一方父母的情况；第二种情况是给定父母双方与子代，排除父母双方的情况；第三种情况是给定一方父母与子代，排除其具有亲缘关系的情况。结果显示三种不同情况下都能成功认定其生物学亲缘关系，因此这12个微卫星位点可以用作亲权鉴定的微卫星标记组合。 本实验还对多重PCR的反应条件进行了探索，成功地优化到了该12个基因座四组三重PCR反应条件。四组分别为： 组合1：ETH10-BM1824-ETH22 组合2：BM1818-INRA023-CSSM66 组合3：ILSTS006-THLA53-INRA037 组合4：INRA063-HEL9-TGLA126 利用多重PCR可以对动物进行遗传分析，但因微卫星片段长度大多为100-300bp，且位点多态性高，同一位点片段长度在不同群体中跨度大，所以在多重PCR的结果分析图上，非特异性条带多，或者有条带重叠而导致判读错误。因此在亲子鉴定中，如果不能使用荧光多重PCR进行分析，那么还是单个位点的PCR分析结果更适合于亲子鉴定。 一般认为微卫星DNA多态性产生的原因是DNA复制和修复过程中的碱基的滑动、错配或减数分裂过程中姊妹染色单体的不均等交换。通过测序分析了其中一个微卫星位点不同基因型的重复单元，测序结果显示：分析结果与理论值一致。

目录

声明

综述

1遗传多样性的检测方法及遗传标记的分类

1.1遗传多样性的检测方法

1.2遗传标记的分类

2分子水平的遗传标记

2.1限制性片段长度多态性（Restriction Fragement Length Polymorphism,RFLP）

2.2随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphism DNA,RAPD)

2.3 DNA单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism,SSCP)

2.4扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Ploymorphism,AFLP)

2.5单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)

3微卫星DNA的定义、分类及形成机制

3.1微卫星DNA的定义、分类

3.2微卫星DNA的形成机制

4微卫星DNA的研究进展及在生产中的应用

5亲子鉴定

5.1亲子鉴定的定义

5.2亲子鉴定的理论基础

5.3亲子鉴定的一般步骤

5.4亲子鉴定的研究进展

6微卫星DNA在牛亲子鉴定方面的研究进展

前言

1实验材料

1.1动物血样

1.2药品和酶

1.3主要仪器

1.4引物设计与合成

1.5分析软件

2实验方法与步骤

2.1溶液试剂配制

2.2实验方法

2.2.1牛基因组DNA的提取(血样)

2.2.2 PCR反应体系条件

2.2.3 PCR产物的检测

2.2.4多重PCR反应条件

2.2.5部分产物回收测序

2.2.6信息采集与数据处理

2.2.7统计分析

3实验结果

3.1 DNA模板

3.2等位基因及其频率

3.3多态信息含量

3.4基因杂合度与有效等位基因数

3.5非父排除率(probability of paternity exclusion,PE)和累积非父排除概率(Cumulate PE,CPE)

3.6多重PCR

3.7亲子鉴定部分图片及数据分析

3.7.1亲子鉴定结果的部分图片

3.7.2父权概率计算

3.7.3成功鉴定的亲子对

3.8 ILSTS006位点测序结果

4讨论

5 小结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文