盐芥激活标签突变体库的建立及过量表达YAP1对拟南芥耐盐性的影响

摘要

本文主要结果如下： 1.盐芥激活标记突变体库的建立以耐盐模式植物盐芥为实验材料，通过农杆菌介导的花浸染法将激活标记载体pSKI015导入盐芥基因组，试图建立一定规模的盐芥激活标记突变体库。主要结果如下： (1)通过农杆菌介导的花侵染法，利用激活标记载体pSKI015对盐芥进行了遗传转化，共获得转化T0代种子1000g左右，通过除草剂筛选，共获得抗性苗约2000株。 (2)通过对所获得的盐芥除草剂抗性苗随机取约800株进行bar基因的PCR检测，阳性率在85％以上，证明采用除草剂对转化突变体进行筛选是可行的。 (3)通过对获得的2000株激活标记抗性苗，采用TAIL-PCR的方法进行农杆菌T-DNA插入盐芥基因组侧翼序列的扩增，并进行测序，得到侧翼序列150余条，并进行了相关的序列分析。 本实验的目的是建立饱和的盐芥激活标记突变体库，但由于各种因素的限制，所获得的体变体的数量还远远不够，大规模的突变体库还在构建之中。利用TAIL-PCR进行侧翼序列的扩增已获得初步成功，只是对于PCR产物的测序方法还有待于进一步完善。 2、YAP1基因在拟南芥中的过量表达通过RT-PCR的方法克隆到YAP1基因，并将其构建到植物表达载体pROKⅡ中，导入农杆菌后，进行植物遗传转化，实现其在拟南芥中过量表达，在含30mg/L的卡那霉素的培养基上筛选获得纯合转基因株系，自交一代获得足够的纯合转基因种子后，对其进行了分子生物学的验证及生理指标的检验，结果如下： (1)通过对转基因植株进行PCR扩增，得到了1.95Kb的特异条带，表明YAP1已整合至拟南芥基因组中； (2)Northern杂交分析表明转基因植株均有杂交信号，野生型植株无明显信号，进一步说明YAP1基因整合到拟南芥的基因组后己正常转录表达。 (3)在含不同浓度的NaCl(0-150mmol/L)MS培养基上，YAP1基因的过量表达提高了转基因拟南芥的种子萌发率及幼苗的耐盐性。 (4)在盐胁迫条件下，转YAP1基因拟南芥表现出比野生型更高的耐盐性，主要表现在：在盐胁迫下，转基因植株保持了更高的光反应效率，MDA、H2O2含量及细胞膜透性明显低于对照，表明YAP1基因减轻了植株的氧化损伤。 (5)在盐胁迫条件下，转YAP1基因植株抗氧化保护酶SOD、CAT、POD、APX、GST及GR的酶活性都显著高于对照，表明酵母YAP1基因在高等植物异源表达能够起到类似转录因子的作用，在胁迫条件下，调控了一系列抗氧化保护酶的表达，增强了拟南芥的抗盐性。 本论文的主要创新点： 1.以耐盐研究模式植物盐芥为材料，通过农杆菌介导的花侵染法将激活标记载体pSKI015大规模的对盐芥进行转化，建立盐芥激活标签突变体库。 目前已获得激活标记突变体2000株，并对所获得的突变体T-DNA插入盐芥基因组侧翼序列进行了扩增，Blast序列比对分析。在本实验室首次较系统的对盐芥激活标记突变体库的建立中的各个环节进行详细研究，为后续研究盐芥的抗盐机理，耐盐基因的发掘利用奠定了基础。 2.从酿酒酵母克隆得到了转录因子YAP1基因，并首次在高等植物拟南芥中进行异源表达，对转化植株进行了相关的分子检测，并对转基因植株的耐盐水平进行了较全面的分析，为进一步培育耐盐作物奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩写符号

声明

第一部分 文献综述

1 高盐对植物的影响

1.1渗透胁迫

1.2离子毒害

1.3氧化的胁迫

2植物耐盐机理

2.1渗透调节

2.2活性氧清除

2.3转录因子与植物的抗逆性

3.耐盐模式植物盐芥(Thellungiella halophila)

4.植物功能基因组学研究方法

5激活标签法建立突变体库

5.1激活标签法概述

5.2激活标签法中的载体

5.3获得T-DNA插入位点侧翼序列的方法

5.4激活标签法在植物功能基因组学研究中的应用研究进展

5.5标记基因的克隆和功能鉴定

6.建立盐芥激活标签突变体库的意义

第二部分实验论文

第一章盐芥激活标签突变体库的建立

1实验材料

2.实验方法

3实验结果及分析

4讨论：

第二章 YAP1基因在拟南芥中的过量表达

1实验材料：

2实验方法

3结果与分析

4 讨论

参考文献：

致谢

图版

攻读博士学位期间发表的论文