马尾松花粉多糖硫酸酯结构解析及对心肌细胞钙离子通道的调控作用

摘要

多糖的分子修饰和结构改造即利用糖残基上的羟基、羧基、氨基等基团运用化学方法进行修饰，对提高多糖的生物活性具有重要意义。修饰的方法有很多，如硫酸化、羧甲基化、硒化、甲基化、氧化、部分水解、磷酸酯化、双基团衍生化等。 目前，研究最多的是多糖的硫酸化修饰。多糖经硫酸酯化修饰后，富含SO42-，易与蛋白质的特定结构域结合，由此改变其构象并影响其功能，使其活性增强或改变其原有活性。对于硫酸酯化多糖抗病毒、抗肿瘤、抗艾滋病等研究较多，而对于防治心血管疾病方面却鲜有报道。 本文以马尾松花粉（Pinu smassoniana pollen）为原材料，经60％乙醇沉淀、Sevag法去蛋白后得到多糖(PPM60)，用氯磺酸-吡啶法进行硫酸酯化修饰，得硫酸酯化多糖(SPPM60)，然后对其进行纯化，研究酯化前后及SPPM60纯化组分对细胞内游离钙离子浓度的影响并探讨其对细胞钙离子浓度的调节机制，以期为钙离子激动剂的发展提供理论基础和新的研究方向。 实验具体分为四部分。 一、马尾松花粉多糖的硫酸酯化修饰。 采用氯磺酸-吡啶法对马尾松花粉多糖进行硫酸酯化改性，得到硫酸酯化多糖。用氯化钡-明胶比浊法鉴定硫酸根含量，结果表明，硫酸基质量分数为14.7％，取代度为1.41。红外光谱显示已具有硫酸酯键（C-O-S和S=O）的特征吸收峰，表明多糖已成功硫酸酯化。 二、马尾松花粉多糖硫酸酯的纯化及理化性质测定。 马尾松花粉多糖硫酸酯经SephacrylS-400HR层析后，最后得到五个组分，按沈脱体积大小依次命名为SPPM60-A、SPPM60-B、SPPM60-C、SPPM60-D、SPPM60-E。用不同分子量的葡聚糖作标准品，测得五个组分的分子量大小分别为：1.01×106、6.03×105、1.47×105、3.8×104、1714。HPLC分析其单糖组成发现SPPM60-A主要由D-葡萄糖醛酸，葡萄糖，半乳糖组成；SPPM60-B主要由鼠李糖，D-葡萄糖醛酸，葡萄糖，阿拉伯糖组成；SPPM60-C主要由甘露糖，D-葡萄糖醛酸，半乳糖组成；SPPM60-D主要由甘露糖，葡萄糖，阿拉伯糖组成；SPPM60-E主要由甘露糖，鼠李糖，半乳糖，岩藻糖组成，其中SPPM60-D、E均有一未知单糖出现。 三、各组分对大鼠心肌细胞H9C2(2-1)内游离钙离子浓度的影响。 钙离子荧光探针Fura2-am对心肌细胞进行负载后，采用双波长荧光分光光度计检测其胞内游离钙离子浓度，发现PPM60显著抑制钙离子浓度，而SPPM60却能促进钙离子浓度升高。五个纯化组分作用效果各不相同，其中SPPM60-A、SPPM60-B、SPPM60-D起正向促进作用，而SPPM60-C、SPPM60-E起负向抑制作用。用细胞膜L型钙通道特异性阻断剂维拉帕米作用心肌细胞后检测，发现SPPM60-A、SPPM60-B的正向作用均被抑制，说明SPPM60-A、SPPM60-B是通过膜上的L型钙通道起作用。细胞外液无钙时，SPPM60、SPPM60-A、SPPM60-B、SPPM60-D的正向作用消失，说明其促钙离子浓度的作用是由胞外钙离子起始的。 四、各组分对小鼠脾细胞内游离钙离子浓度的影响。 细胞外液有钙离子时，SPPM60及其五个纯化组分均能提高小鼠脾细胞内钙离子浓度，但PPM60没有显著作用。维拉帕米阻滞膜L型钙通道后，正向促进作用减弱。当细胞外液无钙离子时，采用低分子肝素钠阻滞胞内IP3R，结果SPPM60、SPPM60-A、SPPM60-B的正向作用消失。说明SPPM60及其五个纯化组分既能通过L型钙通道起作用，也能启动细胞内钙释放通路来发挥作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章综述

1.松花粉

2.糖类物质的研究现况

3.多糖的改性

4.钙离子的研究现状

第二章 马尾松花粉多糖的硫酸化修饰及鉴定

1.实验材料与试剂

2.实验仪器与设备

3.方法步骤

4.结果与讨论

第三章马尾松花粉多糖硫酸酯的纯化、纯度鉴定及理化性质测定

1.实验材料与试剂

2.实验仪器与设备

3.方法步骤

4.结果与讨论

5.红外光谱分析

第四章马尾松花粉多糖硫酸酯及各纯化样品对大鼠心肌H9C2(2-1)细胞内游离钙离子浓度的影响

1.实验材料

2.实验仪器与试剂

3.方法步骤

4.结果与讨论

第五章马尾松花粉多糖硫酸酯各纯化样品对小鼠脾细胞内游离钙离子浓度的影响

1.实验材料

2.实验仪器和试剂

3.方法步骤

4.结果与讨论

结 论

参考文献

附 图

致 谢

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