大鼠缺氧预处理与缺血性脑损伤后外周及中枢免疫细胞的变化研究

摘要

目的：检测外周免疫细胞（T细胞、NK细胞）在缺氧预处理与缺血性脑损伤后外周血中的变化；检测中枢免疫细胞（小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞）在缺氧预处理与缺血性脑损伤后大脑皮质中表面标记物的表达量变化以及细胞数目、形态变化；探讨免疫系统在缺氧预处理与缺血性脑损伤中的变化及可能的作用机制。
　　方法：将70只SPF级健康雄性SD（Sprague Dawley）大鼠按随机分组法分成5组：正常对照组（N，12只）、假手术组（S，15只）、缺氧预处理组（HP，13只）、脑梗死组（M，15只）、缺氧预处理+脑梗死组（HM，15只）。MCAO术后24h用Longa5分评分法对大鼠神经功能进行评分；用imageJ软件分析测量大鼠脑梗死面积；流式细胞仪检测外周动脉血中T细胞（CD4+、CD8+百分率）和NK细胞；实时定量聚合酶链反应检测梗死侧大脑皮质中Iba1、CNP-ase、GFAmRNA表达水平；免疫组化观察大鼠正常脑组织与梗死脑组织小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的数目与形态学变化。
　　结果：与M组比较，HM组大鼠神经功能缺损症状较轻，神经功能评分较低（p<0.05），脑梗死面积减小（p<0.05）；流式细胞仪检测各组T细胞（CD4+、CD8+百分率）、NK细胞（CD161+百分率）无差异（p>0.05）；各组PCR结果显示：与N组比较，HP组大鼠Iba1基因表达量降低（p<0.05），与M组比较， HM组大鼠Iba1基因表达量降低（p<0.05）；与N组比较，HP组大鼠CNP-ase基因表达量降低（p<0.05）;GFAP基因在各组无明显变化（p>0.05）；各组免疫组化结果显示：N组小胶质细胞呈高度分支状，HP组细胞形态及数目无明显变化（p>0.05）；M组小胶质细胞活化，突起数目减少或消失，细胞形态呈圆形或阿米巴状，缺血边缘区小胶质细胞数目增多（p<0.05）；HM组小胶质细胞突起数目减少无M组明显，细胞多为分支状，缺血边缘区小胶质细胞数目低于M组（p<0.05）；与 N组比较，HP组星形胶质细胞突起增粗，数目无明显变化（p>0.05）；与N组比较，M组星形胶质细胞数目增多（p<0.05）；M组和HM组星形胶质细胞发生活化，细胞胞体增大，突起增长增粗，缺血边缘区星形胶质细胞数目增多，M组与HM组星形胶质细胞数目无明显差异性变化（p>0.05）；与N组比较，HP组少突胶质细胞数目减少（p<0.05），少突胶质细胞在M组和HM组形态发生了变化，表现为突起增多、增粗，但这两组间少突胶质细胞数目未见明显差异性变化（p>0.05）。
　　结论：⑴缺氧预处理能够减轻缺血性脑损伤后神经功能缺损症状、减小脑梗死的面积，发挥脑保护作用；⑵在脑梗死24h，梗死中心区神经元数量明显减少，小胶质细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞数量也减少，并且胶质细胞形态发生变化，提示梗死一旦发生，会很快对脑细胞产生影响。⑶缺氧预处理后，脑梗死大鼠小胶质细胞表达降低，活化状态的细胞减少，提示缺氧预处理可能通过抑制小胶质细胞的进一步活化，从而抑制其神经毒性，发挥神经保护作用；少突胶质细胞和星形胶质细胞可能也参与了缺氧预处理脑保护作用。⑷大鼠脑梗死24h后，外周血液中T淋巴细胞（CD3+/CD4+、CD3+/CD8+）和NK细胞（CD161+）百分率未见明显升高，提示外周免疫细胞可能在卒中后不同时期变化不一致，免疫细胞功能的抑制或降低可能参与了脑卒中诱导的免疫抑制综合征。

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主要符号对照表

第1章 前言

第2章 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验仪器

2.2 实验分组

2.3 实验方法

2.3.1 缺氧预处理模型制作

2.3.2 大脑中动脉闭塞模型制作

2.3.3 大脑中动脉闭塞模型成功的评定标准

2.3.4 腹主动脉抽血

2.3.5 脑组织样品制备

2.3.6 TTC染色法测量脑梗死面积

2.3.7 流式细胞术分离T细胞（CD4+、CD8+）、NK细胞（CD161+）

2.3.8 实时荧光定量PCR检测Iba1、CNP-ase、GFAP mRNA的表达

2.3.9 免疫组化检测Iba1、CNP-ase、GFAP的表达

2.4 统计学分析

第3章 结果

3.1 神经功能缺失症状评分

3.2 脑卒中后梗死面积计算

3.3 流式细胞仪筛选T细胞、NK细胞

3.4 Iba1、CNP-ase、GFAP在梗死侧大脑皮质中的mRNA表达量

3.4.1 Iba1在梗死侧大脑皮层中的mRNA表达量

3.4.2 CNP-ase在梗死侧大脑皮层中的mRNA表达量

3.4.3 GFAP在梗死侧大脑皮层中的mRNA表达量

3.5 大鼠梗死侧Iba1、CNP-ase、GFAP免疫组化结果

第4章 讨论

4.1 大脑中动脉闭塞（MCAO）模型的制备

4.2 缺血性脑损伤对免疫系统变化的影响

4.3 缺氧预处理对免疫系统变化的影响

第5章 结论

参考文献

附录A

综述:小胶质细胞及其在缺血性脑卒中的损伤作用

致谢

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