葡萄糖氧化酶产生菌的诱变育种及条件优化

摘要

葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase,GOD)是一种需氧脱氢酶,在有氧条件下能专一性的催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢.它是一种生物催化剂,在医疗诊断、科学研究、食品工业等领域具有很大的应用价值.
　　目前,葡萄糖氧化酶虽然已有商品出售,但是我国生产的葡萄糖氧化酶酶制剂活力比较低、稳定性也较差,所以一直以来几乎依赖进口.因此,提高葡萄糖氧化酶的活力及稳定性,实现葡萄糖氧化酶的国产化具有重要意义.本文通过对黑曲霉菌株进行诱变处理,筛选出了酶活较高的菌株,并通过条件优化的方法进一步提高酶活力,最后我们进行了粗酶夜酶学性质的研究。结果如下:
　　诱变育种结果:以实验室保藏的黑曲霉菌株为出发菌株,初始酶活是1.21U/mL,通过紫外诱变、微波诱变处理,最终筛选出了一株葡萄糖氧化酶活力较高且突变型稳定的突变株C3,酶活达到5.32U/mL,是初始菌株的4.3倍.
　　培养基的优化结果:选择不同含量的有机氮源蛋白胨、豆饼粉、尿素、酵母浸粉以及无机氮源(NH4)2SO4、NaNO3等.结果显示蛋白胨在浓度为0.4％的时候对产酶影响最大,使酶活达6.21U/mL.无机氮源NaNO3在浓度为0.6％的时候对产酶效果最好,使最大酶活可以达到6.15U/mL.选择不同含量的工业葡萄糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦麸、可溶性淀粉做碳源.结果显示在蔗糖浓度12％的时候对产酶影响最大,使酶活可以达到6.25U/mL,可溶性淀粉作为发酵的碳源,菌体生长很少而且酶活很低;麦麸做为液体发酵的碳源时,菌丝体都缠绕在麸皮上,不利于粗酶液的制备;乳糖做为碳源菌体几乎不生长,可能菌体不能利用乳糖.培养基响应面实验优化结果:在蔗糖12.3％、蛋白胨0.41％、NaNO30.60％发酵液中葡萄糖氧化酶活力可达到7.20U/mL,是初始菌株的6倍.
　　发酵条件优化结果为:培养周期为48h时酶活达到最大.在这之后酶活开始下降,酶活下降的原因可能是由于在发酵过程中产生大量的酸使pH迅速下降,以及酶解产物的增加,使酶的产量和酶活都有所降低;在培养温度30℃时酶活最高,温度低于25℃时菌体生长缓慢,酶活较低;温度大于30℃时,葡萄糖氧化酶活力下降;初始发酵液pH在6.0时产酶效果最好,pH值过高或过低都会影响产酶活性,当发酵过程中pH值下降到3以下时,葡萄糖氧化酶的酶活迅速下降;装液量在30mL,接种体积为3％时发酵产酶效果最好,酶活力达到8.70U/mL,其酶活明显高于初始菌株,是初始菌株酶活的7.2倍.降;装液量在30mL,接种体积为3％时发酵产酶效果最好,酶活力达到8.70U/mL,其酶活明显高于初始菌株,是初始菌株酶活的7.2倍.
　　葡萄糖氧化酶的酶活最适温度和最适 pH值是30℃和pH5.5.该酶 pH值稳定性较宽,热稳定性较好.葡萄糖氧化酶 Ag+、Hg2+的作用下受到了很大的抑制.

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第一章 绪论

1.1葡萄糖氧化酶的发展史

1.2 葡萄糖氧化酶的结构

1.3 葡萄糖氧化酶的作用机制及理化性质

1.4 葡萄糖氧化酶的应用

1.5葡萄氧化酶的来源及研究现状

1.6菌株选育的方法

1.7葡萄糖氧化酶活力的测定方法

1.8本课题研究的目的和意义

第二章葡萄糖氧化酶产生菌诱变育种

2.1 材料与方法

2.2 结果与讨论

2.3本章小结

第三章 菌株培养基的优化

3.1 材料与方法

3.2 结果与讨论

3.3本章小结

第四章 葡萄糖氧化酶发酵条件的优化及酶性质的研究

4.1 材料与方法

4.2结果与讨论

4.3本章小结，

第五章 结论及展望

参考文献

致谢

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