探讨TNF-α与Wnt/β-catenin信号通路在小鼠原代前脂肪分化过程中相互作用机制

摘要

肥胖的形成主要由于前脂肪细胞的募集,增生及分化,在全世界范围内,肥胖的发病率逐年递增,现已经成为威胁人类健康的重要疾病,肥胖能够引起糖尿病、血脂升高、动脉粥样硬化和高血压等相关疾病,同时也可诱发哮喘,乳腺癌及脂肪肝。近年来,随着世界范围内肥胖率的上升,引起了人们广泛的关注。 目前,肥胖也被认定为一种慢性炎症疾病,与炎症反应有着千丝万缕的关系。过去TNF-α一直被认为是一种炎症因子,在炎症反应中起到重要作用,近年来TNF-α作为一种新的脂肪因子进入人们的视线。Wnt/β-catenin信号通路的激活可以抑制前脂肪细胞的分化,然而其在肥胖发生,特别是在脂肪细胞形成过程中是如何发挥作用的人们仍然不甚明了。因此,TNF-α与Wnt/β-catenin信号通路可能存在一定的串话,相互作用影响前脂肪细胞的分化。 本论文通过研究TNF-α对Wnt/β-catenin信号通路的关键分子β-catenin的影响,及成脂相关蛋白PPARγ、adiponectin在诱导不同时期变化情况,探讨TNF-α与Wnt/β-catenin信号通路在小鼠原代前脂肪分化过程中相互作用机制,实验结果显示: ①采用胶原酶消化法,获得小鼠原代前脂肪细胞,成功分离、培养、建立了原代小鼠前脂肪细胞模型。 ②使用不同诱导方法诱导小鼠原代前脂肪细胞成脂分化,找到最佳诱导方法,成功诱导小鼠原代前脂肪细胞,使其在诱导终了时成脂分化率达80%,摸索出较为稳定的诱导条件,为后续实验奠定细胞基础。 ③在WT小鼠细胞诱导同时,外源添加不同浓度TNF-α,结果显示:外源添加浓度为100ng/mL的TNF-α能够极显著抑制前脂肪细胞分化(p<0.01),维持细胞未分化状态,降低诱导率,故实验采用外源添加100ng/mLTNF-α。在诱导过程中使用TNF-α缺失小鼠及外源添加TNF-α的WT小鼠原代前脂肪细胞,成功建立了TNF-α过表达及缺失细胞模型,为研究TNF-α与Wnt/β-catenin信号通路互作机制奠定基础。形态学观察,添加TNF-α后细胞维持未分化状态,抑制前脂肪细胞的分化,在诱导后第14天成脂率较WT对照组极显著降低(p<0.01);TNF-α缺失小鼠前脂肪细胞诱导率显著增加(p<0.05),证明了TNF-α抑制前脂肪细胞分化。 ④在分子水平上,随着诱导时间的延长β-catenin mRNA及蛋白表达量下调,成脂相关蛋白PPARγ及adiponectin表达上调,说明Wnt/β-catenin信号通路激活抑制前脂肪细胞分化,而添加TNF-α后WT小鼠中β-catenin mRNA及蛋白表达量同比显著上升(p<0.05),成脂相关蛋白PPARγ及adiponectin表达下调极显著(p<0.01)。因此推测:TNF-α通过与膜上受体结合后,进入细胞质基质,维持β-catenin不被降解,进入细胞核,从而激活Wnt/β-catenin信号通路,降低成脂相关蛋白的表达,抑制前脂肪细胞分化。

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文章综述

1. 前脂肪细胞

2. TNF-α

3. Wnt/β-catenin信号通路

4 论文研究的目的及意义

实验部分

第一章 TNF-α缺失小鼠基因型鉴定

1. 材料与试剂

2. 主要设备与仪器

3. 实验方法与步骤

4. 实验结果

5 分析与讨论

第二章 原代前脂肪细胞分离培养

1. 材料与试剂

2. 主要设备与仪器

3. 实验方法与步骤

4. 实验结果

5. 分析与讨论

第三章 原代前脂肪细胞成脂诱导分化

1. 材料与试剂

2. 主要设备与仪器

3. 实验方法与步骤

4. 实验结果

5. 分析与讨论

第四章 TNF-α对前脂肪细胞成脂分化的影响

1. 材料与试剂

2. 主要设备与仪器

3. 实验方法与步骤

4. 实验结果

第五章 前脂肪细胞分化不同时期TNF-α对β-catenin基因表达的影响

1. 材料与试剂

2. 主要设备与仪器

3. 实验方法与步骤

4. 实验结果

5. 分析讨论

第六章 前脂肪细胞分化不同时间TNF-α对β-cateinin及成脂相关蛋白的表达影响

1. 材料与试剂

2. 主要设备与仪器

3. 实验方法与步骤

4. 实验结果

5. 分析讨论

小结

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢