FAK在小鼠早期胚胎发育中的定位表达及功能研究

摘要

粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是蛋白质酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)的一个家族,它属于非受体型酪氨酸蛋白激酶。黏着斑激酶家族的成员包括FAK和富含脯氨酸的蛋白酪氨酸激酶2/细胞粘附激酶β(proline—rich tyrosine kinase2/cellular adhesion kinaseβ,PYK2/CAKβ)。FAK是一种进化上高度保守的蛋白质,在体内分布广泛。FAK既能定位于皮质部位,又能分布在细胞核中。FAK是粘附分子超家族整合素(integrin)介导的信号转导过程中的一个关键酶,在细胞内信号转导中具有重要作用,是细胞内多条信号转导通路的交汇点,介导细胞与细胞外基质之间的作用。FAK通过其磷酸化而作用于胞质内相应的功能蛋白,从而有利于肿瘤细胞的黏附、降解和迁移。研究发现FAK对肿瘤的增殖、生存、迁移、侵袭、转移和血管形成等行为起着重要的调控作用。FAK与细胞多种信号转导有关,因此对细胞的多种生物学功能具有调节作用。研究表明, FAK对于胚胎发育有重要作用,对细胞的黏附、伸展、迁移、增殖和凋亡具有调节作用。
　　有研究表明,在26天大的小鼠的卵巢中,FAK在卵母细胞的皮质集中表达。跨越透明带的卵丘细胞突也表达FAK,磷酸化后的FAK参与PTK的信号转导。Masahiro Sakurai等人研究了FAK在小鼠卵巢的卵泡发育过程的分布及作用,发现总FAK和pY397 FAK在卵巢中高度表达,定位于卵巢卵泡的颗粒细胞,尤其是在腔前卵泡的颗粒细胞上。在闭锁卵泡的颗粒细胞中,pY397 FAK减少。到目前为止,已有研究集中在对卵泡发育,卵母细胞及胚胎的后期发育中的FAK表达及功能研究,未见对FAK在小鼠受精卵及早期胚胎发育囊胚前各阶段中的表达定位及功能研究的相关报道。
　　本文通过使用免疫荧光染色技术、激光扫描共焦显微镜技术、抑制剂干扰等方法对FAK在卵母细胞和早期胚胎发育过程中的定位及功能进行研究。并且对两种检测方法的效果进行了对比。研究发现:
　　(1)在卵母细胞的GV期、GVBD期、MI期、MII期,FAK在卵母细胞的皮质部位定位;
　　(2)在受精卵及2、4、8细胞各时期,FAK在皮质部位及细胞核中定位,在细胞与细胞的连接处有弱分布;在桑葚胚时期,FAK定位于细胞的顶部及基底部以及细胞与细胞的连接处和细胞核中;囊胚时期,FAK定位于细胞的顶部与基底部以及细胞与细胞的连接处和细胞核中;
　　(3)pY397FAK在受精卵的皮质和细胞核中定位,在2细胞、4细胞和8细胞时期的皮质和细胞核中定位,在细胞与细胞的连接处也存在弱分布,在桑葚胚和囊胚时期,pY397FAK定位在细胞的顶部及基底部以及细胞与细胞的连接处;
　　(4)pY576/577FAK在受精卵皮质及2细胞、4细胞和8细胞时期的皮质和细胞与细胞的连接处有弱分布,在囊胚时期的细胞的顶部及基底部以及细胞与细胞的连接处定位;
　　(5)FAK与F-actin在受精卵的皮质部位共定位;
　　(6)使用黏着斑激酶抑制剂PF573228处理受精卵,抑制了受精卵的卵裂,表明pY397FAK可能参与了受精卵的卵裂;
　　(7)方法1(PFA+BSA)可以较好检测FAK在2、4、8细胞时期时的皮质定位与细胞连接处定位,方法2(PFA/Tritonx-100+BSA/Gly)可以清晰显示FKA在各个胚胎时期的细胞核定位以及桑葚胚与囊胚时期的皮质(顶部)及细胞连接处(基底部)的定位;方法2(PFA/Tritonx-100+BSA/Gly)对于pY397FAk与pY576/577FAK的亚细胞定位检测效果好于方法1。不论是桑葚胚还是囊胚时期,对于FAK或p-FKA的定位检测,方法2显著优于方法1。

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文献综述

实验研究

1.实验材料

1.1 实验试剂

1.2 主要实验仪器

1.3主要耗材

1.4实验动物

2. 实验方法

2.1不同时期卵母细胞的收集及培养

2.2 体内不同发育阶段早期胚胎的获取:

2.3 免疫荧光染色法检测 FAK 在小鼠卵母细胞及早期胚胎皮质中的表达：

2.4 免疫荧光染色法检测FAK在小鼠早期胚胎细胞核中的表达：

2.5 免疫荧光染色法检测 pY397FAK与 pY576/577FAK在小鼠早期胚胎中表达：

2.6 免疫荧光染色法检测纤维状肌动蛋白（F-actin）在小鼠早期胚胎中表达：

2.7免疫荧光双标记法检测纤维状肌动蛋白（F-actin）与FAK在小鼠早期胚胎中的表达：

2.8使用黏着斑激酶抑制剂PF573228处理小鼠早期胚胎

2.9 蛋白共定位的激光扫描共焦显微镜图像分析

2.10两种检测方法对FAK及p-FAK在小鼠早期胚胎中亚细胞定位的免疫荧光染色的影响

3. 实验结果及讨论

3.1 FAK在小鼠卵母细胞中的亚细胞定位

3.2 FAK在小鼠早期胚胎发育过程中不同发育时期时的亚细胞定位

3.3 pY397FAK在小鼠早期胚胎发育过程中不同发育时期时的亚细胞定位

3.4 p576/577FAK在小鼠早期胚胎发育过程中不同发育时期时的亚细胞定位

3.5 FAK与F-actin共定位

3.6 黏着斑激酶抑制剂PF573228处理对小鼠胚胎卵裂的影响

3.7 两种检测方法对FAK及p-FAK在小鼠早期胚胎中亚细胞定位的免疫荧光染色的影响

结语

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢