多种金属离子的单细胞分析及细胞膜蛋白的单分子检测

摘要

在生物体内，各种各样的生物分子发挥着至关重要的作用。如基因能够调控信号传递及代谢通路，蛋白质组学则在一定程度上反应基因表达水平，金属离子在神经系统中能够促进神经递质的释放和分泌、调节神经突触的形成及生长等。各种生物分子之间彼此关联、协同作用、相互影响，一种生物分子的异常表达往往会引起一系列的变化，因此各种生物分子与细胞功能的正常运作、各种疾病的发生与发展以及相关治疗密不可分。
　　目前已发展了多种针对细胞内生物分子的研究方法，包括电化学检测、质谱以及光学检测等，其中荧光法由于检测灵敏度高等优点已得到广泛应用。但是目前的方法对于单细胞水平甚至是单分子水平的生物分子的检测仍然存在许多困难，如生物分子的尺度一般为纳米级，检测方法需具有较高的空间分辨；某些分子含量较少，低灵敏度的方法难以实现其精确的检测；另外由于细胞成分较为复杂，如何消除其他分子的信号干扰也是一大挑战。因此，急需发展高灵敏的单细胞内生物分子检测方法。
　　针对这些困难与挑战，本论文致力于发展高灵敏度的检测方法用于细胞内生物分子的检测。首先我们在单细胞的水平上，发展了一种单细胞内多组分的同时定量检测的方法，并且进一步提高了检测灵敏度，构建了一种单分子水平上的细胞膜蛋白的检测方法。论文主要包括以下四个部分：
　　第一章为绪论，首先概述了目前细胞内各种生物分子检测的研究进展，其中包括生物分子的重要生理功能及荧光检测方法的简介；随后介绍了单细胞水平上的生物分子的检测重要性及单细胞内多种金属离子同时定量检测的重要性，并总结了用于单细胞检测的微流控方法的优势；最后介绍了单分子检测的研究进展以及单分子水平上细胞膜蛋白检测的意义及方法。
　　第二章介绍了基于目前单细胞水平上多种金属离子检测的困难，为了解决这些困难我们发展了一种基于微流控系统同时定量检测单个神经细胞内 Na+, K+, Ca2+, Mg2+四种金属离子的新方法，并将该方法应用于研究Aβ25-35诱导的PC-12细胞内四种离子的变化情况。该方法为单细胞内多种金属离子的研究提供了一种新的思路，同时研究结果也为多种金属离子如何在神经疾病的调节中发挥协同作用提供了新的启示。
　　第三章在单细胞检测的基础上，进一步提高检测灵敏度，发展了一种单分子水平上的细胞膜蛋白的检测方法。选取了细胞膜蛋白PTK7作为研究对象，利用核酸适配体高效靶向目标膜蛋白，并通过引入滚环扩增反应来实现信号的放大，从而发展一种灵敏度好、毒性小、可进行细胞原位单分子成像检测的方法。该方法的检测灵敏度也能够满足低丰度的细胞膜蛋白的单分子检测。最后对本论文所建立的单细胞及单分子检测方法进行了总结。本论文在提高检测灵敏度的角度上，针对单个细胞内的多种金属离子实现了同时定量检测，并进一步提高检测灵敏度，研究了单分子水平上的细胞膜蛋白。这两种方法逐渐递进，本质都是针对细胞内生物分子的研究。而基于本论文建立的方法，细胞内其他生物分子的单细胞及单分子水平的检测还需更进一步的探索。

目录

声明

主要符号与缩写

第一章 绪 论

1生物分子检测的研究进展

1.1细胞内生物分子的检测意义

1.2细胞内生物分子的荧光检测方法

2微流控系统用于单细胞组分的检测

2.1单细胞检测的重要性

2.2基于微流控系统的单细胞的检测

3细胞膜蛋白的单分子检测

3.1单分子检测的重要性

3.2细胞膜蛋白检测的重要性

3.3细胞膜蛋白的单分子检测方法

4本论文研究方法

参考文献：

第二章 基于微流控系统的单个类神经元细胞内K+, Na+, Mg2+, Ca2+的同时定量检测

1 引言

2实验部分

2.1材料与仪器

2.2样品的预处理

2.3基于微流控芯片的K+，Na+，Mg2+，Ca2+的测定

2.4阿尔兹海默症模型

2.5 MTT实验

2.6 凋亡验证实验

2.7 Na+/K+-ATPase 活性

3结果与讨论

3.1三种荧光探针的相关表征

3.2 基于微流控系统检测K+，Na+，Mg2+，Ca2+

3.3单个PC-12细胞内K+，Na+，Mg2+，Ca2+同时检测

3.3离子通道激活剂/拮抗剂刺激的PC-12细胞中四种离子浓度变化分析

3.5 Aβ25-35诱导的单个PC-12细胞内K+，Na+，Mg2+，Ca2+的浓度变化及分析

4总结

参考文献

第三章 基于适配体和滚环扩增反应的信号放大进行膜蛋白的单分子检测

1 引言

2实验部分

2.1材料与仪器

2.2细胞培养

2.3滚环扩增反应

2.4荧光光谱检测

2.5全内反射荧光成像及图像的处理

3结果与讨论

3.1滚环扩增反应机理

3.2方案可行性验证

3.3特异性实验

3.4实验反应条件优化

3.5细胞毒性实验

3.6细胞的荧光共聚焦成像

3.7细胞的单分子成像

4结论

5全文总结

参考文献

作者发表的学术论文及参加的课题

致谢