逆境因子对棘孢木霉产嗜铁素及钙调磷酸酶基因表达的影响

摘要

木霉菌（Trichoderma spp.）是一类能够促进植物生长、提高植物抗胁迫能力的植物根际益生真菌，能在低铁环境下产生次级代谢产物嗜铁素（siderophore）。真菌的次生代谢常受到已知信号通路的调控，钙调磷酸酶（calcineurin）作为Ca2+信号途径的关键调节酶在真核生物中介导多个生物学过程。但钙调磷酸酶基因在棘孢木霉中的功能研究未见报道。 目前对木霉及嗜铁素功能研究主要集中在促生和生防作用方面且为生理水平，对木霉本身在逆境胁迫因素下的生长、产孢和嗜铁素合成的情况以及三者之间的规律关系，以及他们的分子调控机制尚缺乏深入、系统的研究。同时，本实验室前期已证明缺铁胁迫能诱导木霉产大量的嗜铁素，但其它胁迫因素对木霉嗜铁素合成的影响尚不明确，因此，了解更多影响木霉嗜铁素合成的因素，明确木霉抗逆和嗜铁素合成的分子调控机制对提高木霉嗜铁素产量，扩大木霉在工业和农业上的应用，增强木霉生物防治能力等具有重要意义。 因此本文以实验室保藏并鉴定的棘孢木霉（T. asperellum）T6为材料，初步研究了氯化钠盐、酸碱、缺碳、缺氮和过氧化氢六种胁迫因素下棘孢木霉T6的生长、产孢、嗜铁素的产量和菌丝生物量的变化情况，以及氯化钠盐胁迫和缺氮胁迫下，棘孢木霉T6细胞中钙调磷酸酶催化亚基基因（CNA）表达情况，并探索钙调磷酸酶信号通路与嗜铁素合成之间的规律。 通过PEG介导的double-joint转化方法，构建了棘孢木霉T6的钙调磷酸酶CNA基因敲除载体，初步探索了CNA基因对棘孢木霉菌丝生长和产孢的影响和此方法在棘孢木霉中的适用条件。但未得到CNA基因敲除突变体。研究具体结果如下： 1 通过平板胁迫实验，测定了六种胁迫因子对T6的生长、产孢的影响，通过液体摇培实验测定了单位质量菌丝嗜铁素相对含量的变化，结果如下， （1）盐胁迫：通过实验测定了氯化钠盐胁迫对棘孢木霉 T6的生长、产孢和嗜铁素合成的抑制作用，300 mM氯化钠盐胁迫下CNA基因的表达上调，与钙调磷酸酶抑制剂实验结果相呼应。结果说明，氯化钠盐胁迫不是木霉合成嗜铁素的诱因，嗜铁素的合成可能与钙调磷酸酶信号通路有关。 （2）酸碱胁迫：测定了酸碱度对 T6的生长、产孢和嗜铁素合成的影响，结果表明，酸性条件最利于棘孢木霉T6的生长和产孢，二者随pH升高而减弱；中性条件下嗜铁素产量最高，碱性次之，酸性最少。说明面对酸碱胁迫时，木霉的生长、产孢和嗜铁素合成三个生物学过程的应答结果并不完全一致，其中生长速度与嗜铁素合成之间不是正相关关系，酸碱胁迫能影响嗜铁素的合成，但不是嗜铁素合成的诱因。 （3）缺碳胁迫与缺氮胁迫：结果表明，缺碳抑制了棘孢木霉生长和嗜铁素合成，但促进了产孢；缺氮三者均受严重受抑，此时嗜铁素无法通过分光光度计检测；CNA 基因的表达上调。说明缺碳和缺氮不是木霉嗜铁素合成的诱因，但木霉可能会在碳源稀缺时时优先产生孢子；木霉的抗缺氮胁迫和嗜铁素合成可能与钙调磷酸酶信号通路有关，钙调磷酸酶基因可能负调控木霉嗜铁素的产生。 （4）过氧化氢胁迫：结果表明，H2O2抑制了木霉的生长和产孢，H2O2浓度越高，抑制率越高；H2O2抑制嗜铁素产生，但高浓度下的产量高于低浓度。说明H2O2是影响木霉嗜铁素的产生因素，但H2O2不是诱导嗜铁素产生的因素。 环孢菌素A（CsA）：加入钙调磷酸酶专性抑制剂CsA，嗜铁素含量升高，说明嗜铁素的产生可能与钙调磷酸酶信号通路有相关性。 2、 基因敲除突变体：成功构建基因敲除载体并导入木霉原生质体，经过潮霉素B抗性标记筛选，得到的转化子。平板实验测定结果表明，转化子的生长减慢，产孢量降低但菌丝形态没有明显变化。此外，探索了PEG介导的double-joint转化方法在棘孢木霉中的适用条件。

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