卵泡刺激素对体外培养小鼠卵巢促血管生长相关因子表达的影响

摘要

目的：冻存卵巢的移植是恢复因恶性肿瘤放化疗所致卵巢早衰患者生育力的重要方法，然而卵巢移植后的缺血缺氧仍然是影响卵巢移植效果的最严重的问题。虽然已有研究表明移植后给予促性腺激素干预可以提高卵泡存活率，但其长期干预可致卵泡储备下降。因此，摸索适宜的促性腺激素干预方式已成为提高移植卵巢存活率和延长功能寿命必须要解决的问题。故本实验通过培养液中添加不同浓度的卵泡刺激素（folliclestimulatinghormone,FSH），探索短暂的体外培养干预对小鼠卵巢促进血管生成相关因子表达的影响；并筛选出最佳的体外干预时间，为卵巢移植提供FSH干预的有效浓度和时间和科学依据。
　　方法：1.取6-8周动情间期小鼠卵巢进行体外短暂培养，根据体外培养液中FSH浓度的不同分为四组（0.00IU/mL、0.15IU/mL、0.30IU/mL、0.60IU/mL），于培养0h、3h、6h、12h、24h收集标本，进行下列观察分析：（1）通过免疫组织化学法，观察卵巢组织内VEGF、bFGF、VEGFR、bFGFR、及FSHR的表达细胞定位及阳性强度变化情况；（2）将青春期小鼠卵巢在含0.00IU/mL、0.30IU/mL浓度FSH的培养液体外培养3h、6h、12h、24h后，提取总RNA，通过实时荧光定量PCR法观察VEGF、bFGF、VEGFR、bFGFR、及FSHR在转录水平的表达情况；(3)将青春期小鼠卵巢在含0.00IU/mL、0.30IU/mL浓度FSH的培养液体外培养3h、6h、12h、24h后，提取总蛋白，通过western-blot的方法对VEGF、bFGF、VEGFR、bFGFR、及FSHR的蛋白进行定量观察。
　　结果：（1）免疫组织化学染色显示：①干预组随着FSH浓度的增加VEGF、VEGFR、bFGF和bFGFR的表达量逐渐增大，各浓度组间差异显著。0.15IU/mLFSH和0.30IU/mLFSH干预组显示12hVEGF表达量达到高峰，除组内24h外,与其各组比较P<0.05。0.6IU/mLFSH干预组显示24h组VEGF表达量达到高峰。与同时间其他各组均有差异（P<0.05）。非干预组VEGF、VEGFR、bFGF、bFGFR随着时间的延长出现下降的趋势。0.15IU/mL、0.30IU/mL和0.60IU/mLFSH体外干预3hFSHR表达量达高峰，0.15IU/mLFSH各干预时间组间无显著性差异（P>0.05），但低于其他各组（P<0.05）。0.30IU/mLFSH干预3h组与其他各组均有差异（P<0.05）。0.6IU/mLFSH3h组与24h组没有差异（P>0.05），但与6h和12h组均有差异（P<0.05）。对照组表达量明显低于其他各组。
　　（2）实时荧光定量PCR观察结果表明：非干预组VEGFmRNA的表达量随着时间的延长而逐渐下降，0.30IU/mLFSH干预组VEGFmRNA的表达量随着时间的延长而逐渐增加，高峰出现在培养24h组，与其它各组均有意义（P<0.05）。VEGFRmRNA随着FSH干预时间的延长表达量增加，高峰出现在培养24h组，与其它各组均有意义（P<0.05）。bFGFmRN非干预组表达量高峰出现在0h培养组，0.30IU/mLFSH高峰出现在24h组，与其它各组均有意义（P<0.05）。bFGFRmRNA与bFGF相似，非干预组高峰出现在0h组，0.30IU/mLFSH干预组高峰出现在24h组，FSH干预组与其它各组均有意义（P<0.05）。⑤FSHRmRNAFSH干预组表达量高峰出现在3h组，与其它各组均有意义（P<0.05）。
　　（3）western-blot结果观察：VEGF及其受体表达量与免疫组化结果相近，表现为随着时间的延长其表达量增加，0.30IU/mLFSH干预组高峰出现在12h组，与组内24h组比较无统计学意义（P>0.05），组间比较有统计学意义（P<0.05）。bFGF及其受体与免疫组化结果相近，0.30IU/mLFSH干预组表达量高峰出现在12h组，组间比较有统计学意义（P<0.05）。FSHR与免疫组化结果相近。
　　结论：1.FSH对体外培养24h的小鼠卵巢具有促进卵泡发育和抑制卵泡闭锁的作用。其中培养12h时，0.60IU/mL组原始卵泡数量最低，组间差异显著。2.FSH干预可上调体外培养小鼠卵巢促血管生长相关因子VEGF、VEGFR、bFGF、bFGFR的mRNA及蛋白表达，在12h之内呈剂量-时间依赖性。3.FSH干预可上调体外培养小鼠卵巢FSH受体的表达，3h出现表达高峰，并且呈剂量依赖性。4.体外短暂的FSH干预上调小鼠卵巢血管生成相关因子表达的结果，提示可通过体外的FSH干预提前启动移植前卵巢血管的发生。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

中英文缩略词表

目录

前 言

实验一 FSH对卵泡刺激素受体、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及其受体表达影响的形态学研究

1 材料

2 方法

实验二 FSH体外短暂干预对培养小鼠卵巢血管生成相关因子VEGF、bFGF、VEGFR、bFGFR、FSHR转录水平的影响

1 材料

2 方法

实验三 促性腺激素体外短暂干预对促血管生成因子VEGF、bFGF、VEGFR、bFGFR、FSHR表达影响的蛋白定量研究

1 材料

结 果

1 添加FSH对卵泡发育的影响

2 RT-PCR 结果

3 western-blot 结果

讨 论

1体外FSH干预对卵泡发育的影响

2体外FSH干预剂量对于小鼠卵巢血管生长因子表达的影响

3 体外促卵泡刺激素干预时间对小鼠卵巢血管生长因子表达的影响

4 FSH在转录和蛋白水平对于血管再生因子及其受体表达的时间-剂量依赖性的研究

5 卵泡刺激素与血管生长因子的时空关系

结 论

参考文献

综 述

致谢

攻读学位期间发表的学术论文