细粒棘球蚴谷胱甘肽s-转移酶免疫保护力观察及其免疫机制的研究

摘要

目的:在已克隆并成功构建细粒棘球蚴（Echinococcus granulosus,Eg）重组原核表达质粒pET-28a/GST的基础上，表达并纯化出重组蛋白Eg.GST，进行动物免疫保护力实验及免疫机制研究，以鉴定其疫苗的潜质。
　　 方法:（1）重组表达质粒的诱导表达及纯化：IPTG诱导表达重组蛋白EgGST（rEgGST），经含Ni2+的His-bind树脂柱纯化rEgGST。（2）动物分组及免疫方案：选取132只雌性6周龄ICR小鼠随机分为3组即实验组、佐剂+PBS组和PBS组，每组44只；采用背部皮下多点注射，连续免疫3次，每次间隔两周；免疫小鼠10周后，每只小鼠用1500个活原头蚴腹腔注射进行攻击感染。分别于免疫前和攻击后的0周、2周、4周、6周、10周、18周、30周剖杀小鼠，并且眼眶取血分离血清。（3）rEgGST诱导小鼠的免疫保护力的计算：根据Dempster公式：免疫保护力（％）=（1-免疫组平均包囊数/对照组平均包囊数）×100﹪，计算免疫保护力（4）rEgGST诱导小鼠的免疫保护力及其机制研究：①通过ELISA方法对rEgGST诱导小鼠体液免疫指标的变化进行研究；②通过流式技术对rEgGST诱导小鼠细胞免疫指标的变化进行研究；③rEgGST诱导小鼠细胞因子变化的研究及MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况。
　　 结果（1）：将已经构建的基因工程菌株Eg.GST/pET-28a/BL21(DE3) plysS，表达并纯化出分子量约28kD的重组EgGST。（2）：根据公式计算rEgGST能诱导小鼠产生89.39％的免疫保护力。（3）①rEgGST组小鼠在抗原免疫后和攻击感染后均产生高水平的IgG、低水平的IgG1和IgE，IgG2a、IgG2b和IgG3抗体水平与免疫前相比是升高的，提示IgG、IgG3、IgG2a和IgG2b可能参与保护性的免疫应答机制。②rEgGST组小鼠在攻击感染后不仅CD4+T细胞增加，CD8+T细胞也有轻度增加，CD4+/CD8+比值与PBS对照组比较有所降低；在攻击感染后30周rEgGST组的CD25+细胞和佐剂组与空白组相比差异具有显著性，而实验组与对照组之间无显著性差异。③rEgGST组小鼠在免疫后产生高水平的IL-2、IFN-γ和TNF-α，低水平的IL-4和IL-10；攻击感染后期IL-2、IFN-γ和TNF-α降低，IL-4和IL-10上升。提示该重组抗原以诱导Th1型免疫应答为主的反应；同时攻击感染后进行脾淋巴细胞增殖试验，MTT法检测证实rEgGST免疫的小鼠在rEgGST刺激下脾淋巴细胞增殖水平明显高于PBS对照组（P<0.01）。
　　 结论:（1）：成功表达并纯化出rEgGST。（2）：rEgGST能诱导小鼠产生89.39％的免疫保护力，提示rEgGST蛋白能诱导机体产生较强的保护力，是一个极具潜力的抗包虫病疫苗候选分子。（3）：rEgGST保护性免疫主要通过诱导宿主产生体液免疫应答和Th1型免疫应答，表明rEgGST是具有发展前途的抗包虫病候选疫苗。