DNA修复酶的超灵敏检测方法研究

摘要

基因组DNA的完整性和稳定性是所有生命体赖以生存的基本先决条件，但是基因组不断遭受到来自外部环境和细胞内各种因素的伤害，造成平均每天每个细胞约产生105个DNA损伤（如碱基修饰、无碱基位点、DNA加合物和DNA链断裂等），引发基因突变甚至细胞死亡。为了降低DNA突变频率，细胞进化出多种DNA保护机制，如碱基切除修复（base excision repair,BER）、核苷酸切除修复（nucleotide excision repair,NER）、同源重组（homologous recombination,HR）修复、错配修复（mismatch repair,MMR）、诱变修复和替代修复机制。在以上DNA保护机制中，对应于不同类型的DNA损伤，存在多种DNA修复酶，以特异性识别并进行有效修复。 根据功能的不同，DNA修复酶可以分为：DNA糖基化酶、多聚核苷酸激酶、磷酸酶、DNA甲基转移酶、DNA核酸内/外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶等。大量科学研究表明DNA修复酶的异常与多种人类疾病（如神经退行性变、免疫缺陷、色素性干皮病、早衰等）和癌症（如肺癌、肝癌、乳腺癌、子宫颈癌等）密切相关。因此，DNA修复酶可以作为多种疾病发展状态的重要标志物和癌症的潜在治疗靶点，开发能够超灵敏检测DNA修复酶的生物传感技术对于基础生化研究和临床医学发展具有十分重要的意义。传统检测技术主要包括：放射标记的凝胶电泳法，酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA），质谱法（mass spectrometry,MS）和高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）。但是，以上方法都有无法避免的缺点，如放射污染、灵敏度低、操作繁琐以及仪器昂贵等，限制了其实际应用。随着科学技术的飞速发展，新的检测技术如比色、发光、电化学和荧光分析法）取得了很大的进步，并被广泛用于化学、生物学、医学等各个领域。鉴于荧光分析法具有操作简单、灵敏度高、选择性好和信号输出方便等优点，受到科研工作者们越来越多的关注。 本论文以胸腺嘧啶DNA糖基化酶（thymine DNA glycosylase,TDG）、人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶（human alkyladenine DNA glycosylase,hAAG）、多聚核苷酸激酶（polynucleotide kinase,PNK）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）为研究对象，发展了基于核酸恒温扩增和单分子成像技术的一系列新型荧光生物传感方法，实现了对多种DNA修复酶活性的高灵敏、高特异检测。本论文主要内容如下： 1.构建一种循环酶修复介导的双信号放大实时检测TDG活性的荧光方法。线性探针与环形模板杂交形成TDG的催化底物。在核酸内切酶IV（endonuclease IV,Endo IV）存在下，TDG特异性地在胸腺嘧啶（thymine,T）位点处切断线性探针，导致3'末端凸出序列的断裂。切断的线性探针产物作为引物引发滚环扩增（rolling circle amplification,RCA）反应，生成含有尿嘧啶（uracil,U）的长片段重复序列。U可以被尿嘧啶DNA糖基化酶（uracil DNA glycosylase,UDG）和Endo IV切除修复，生成带羟基的3'末端以进行新的聚合反应，产生大量的报告序列。报告序列与剩余的环形模板结合引发新的聚合和U切除循环，最终生成大量的报告序列。报告序列与信号探针结合，引发Endo IV对信号探针上的无嘧啶位点循环切割，最终产生放大的荧光信号。该方法的检测限为5.6×10-7U/μL，且可用于测定酶活动力学参数和定量1个癌细胞内TDG活性，为功能基因组研究和生物医学提供了强大的工具。 2.发展一种可控自催化切割介导的荧光恢复检测hAAG活性的荧光方法。在hAAG和人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶（human apurinic/apyrimidinic endonuclease,APE1）存在下，它们能够识别并切割发夹探针1（hairpin probe1,HP1）上的2'-脱氧肌苷位点，展开发夹结构以产生DNA双链体。构建在双链体中的触发探针1（trigger1）将通过粘性末端介导的链置换反应（toehold-mediated strand displacement reaction,TMSDR）与HP2部分杂交以诱导T7核酸外切酶（T7exonuclease,T7exo）催化的HP2和信号探针的两步循环切割，导致荧光信号恢复。该方法的检测限为4.9×10-6U/μL，并且还可用于评估酶活动力学参数，筛选抗癌药物，甚至定量1个Hela细胞内的hAAG活性，为基础生化研究和生物医学应用提供很大的潜力。 3.开发一种磷酸化反应引发的纳米金（AuNP）淬灭荧光信号恢复在单分子水平检测PNK活性的荧光方法。在PNK存在时，其转移三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）的γ-磷酸基团到5'-羟基末端，导致发夹底物的5'末端磷酸化。λ核酸外切酶（λexonuclease,λexo）从5'-磷酸末端催化发夹底物的切割，导致发夹结构的打开和结合探针的形成。添加捕获探针修饰的AuNPs，结合探针与捕获探针杂交形成具有5'-磷酸末端的双链DNA。λexo对双链DNA上的捕获探针进行切割，导致Cy5分子和结合探针的释放。结合探针可与Cy5-捕获探针-AuNP纳米结构上的捕获探针结合，引发消化-释放-杂交的循环，因此释放大量的Cy5分子到溶液中。通过简单统计Cy5分子可准确定量PNK活性。该方法的检测限可达9.77×10-8U/μL，并可用于评估二磷酸腺苷（adenosine diphosphate,ADP）和硫酸铵的抑制作用、定量癌细胞中PNK活性。重要的是，它可作为通用平台检测其他的多聚核苷酸激酶。 4.研发一种引物去磷酸化介导的循环指数扩增在单细胞水平检测ALP活性的荧光方法。设计两个双功能发夹探针（HP1和HP2），同时用作指数扩增（exponential amplification reaction,EXPAR）模板和信号发生器。ALP将DNA底物3'末端磷酸水解成3'末端羟基。去磷酸化的DNA底物与HP1的3'凸出末端杂交以启动第一个（strand displacement amplification,SDA），产生触发物1和荧光信号。释放的触发物1与HP2的3'凸出末端互补以启动第二个SDA，产生触发物2和荧光信号。值得注意的是，触发物2与HP1的3'凸出末端互补可以启动上述两个连续的SDA反应，使循环EXPAR将低丰度的ALP信息转换为指数扩增的荧光信号。该方法的检测限为2.0×10-10U/μL，且可用于测量酶活动力学参数，筛选潜在抑制剂，甚至在单个细胞水平定量ALP活性，对与ALP相关的医学研究、临床诊断和药物发现有重大的意义。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 DNA损伤发生和修复

1.2 DNA修复酶

1.2.1 DNA修复酶概念

1.2.2 DNA修复酶分类及功能

1.2.3 DNA修复酶研究意义

1.3 DNA修复酶检测方法

1.3.1 传统检测方法

1.3.2 新型检测方法

1.4 本论文解决的科学问题和研究内容

1.4.1 解决的科学问题

1.4.2 研究内容

第二章 循环酶修复介导的双信号荧光放大实时检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂和仪器

2.2.2 环形模板制备

2.2.3 酶修复介导的循环双信号荧光放大反应

2.2.4 凝胶电泳分析

2.2.5 荧光强度测量

2.2.6 细胞培养和细胞提取物制备

2.3 结果与讨论

2.3.1 基于循环酶修复介导的双信号荧光放大对 TDG 活性进行实时检测的方案设计原理

2.3.2 方案原理的可行性验证

2.3.3 优化反应条件

2.3.4 灵敏度分析

2.3.5 选择性分析

2.3.6 酶活动力学分析

2.3.7 实际样品分析

2.4 结论

第三章 可控自催化切割介导的荧光恢复检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶活性

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂和仪器

3.2.2 DNA修复控制的T7 exo辅助的自催化循环信号放大

3.2.3 荧光测定和凝胶电泳分析

3.2.4 酶活动力学分析

3.2.5 抑制剂分析

3.2.6 细胞培养和细胞提取物的制备

3.3 结果与讨论

3.3.1 hAAG催化损伤碱基切除修复

3.3.2 基于可控自催化切割介导的荧光恢复对 hAAG 活性进行检测的方案设计原理

3.3.3 方案原理的可行性验证

3.3.4 优化反应条件

3.3.5 灵敏度分析

3.3.6 选择性分析

3.3.7 酶活动力学分析

3.3.8 抑制剂筛选

3.3.9 实际样品中hAAG活性的测定

3.4 结论

第四章 磷酸化反应引发的纳米金淬灭荧光信号恢复在单分子水平检测多聚核苷酸激酶活性

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂和仪器

4.2.2 捕获探针修饰AuNPs的制备

4.2.3 PNK催化的磷酸化和λ exo介导的切割反应诱导的AuNP淬灭荧光的恢复

4.2.4 荧光光谱测量和电泳分析

4.2.5 基于TIRF的单分子检测

4.2.6 抑制剂筛选

4.2.7 细胞提取物的制备

4.3 结果与讨论

4.3.1 基于磷酸化反应引发的 AuNP 淬灭荧光信号恢复在单分子水平检测 PNK活性的设计原理

4.3.2 捕获探针修饰的AuNP的表征

4.3.3 方案原理的可行性验证

4.3.4 反应条件的优化

4.3.5 基于TIRF的PNK活性的单分子检测

4.3.6 选择性分析

4.3.7 抑制剂的筛选

4.3.8 PNK实际样品的检测

4.4 结论

第五章 引物去磷酸化引发的循环指数扩增超灵敏检测碱性磷酸酶活性

5.1 引言

5.2 实验部分

5.2.1 试剂和仪器

5.2.2 引物去磷酸化引发的等温环状指数扩增反应

5.2.3 实时荧光测量和凝胶电泳

5.2.4 荧光强度测量

5.2.5 抑制剂的筛选

5.2.6 细胞培养和细胞提取物制备

5.3 结果与讨论

5.3.1 引物去磷酸化引发的循环指数扩增检测碱性磷酸酶（ALP）活性的荧光方法的设计原理

5.3.2 方案原理的可行性验证

5.3.4 反应条件的优化

5.3.5 灵敏度分析

5.3.6 酶活动力学分析

5.3.7 选择性分析

5.3.8 抑制剂筛选

5.3.9 实际样品分析

5.4 结论

第六章 总结与展望

6.1 总结

6.2 展望

参考文献

攻读博士学位期间的科研成果

致谢