基于CRISPR/Cas9技术进行NLRP3基因稳定敲除细胞株的构建

摘要

CRISPR/Cas9技术是由细菌、古细菌的适应性免疫系统CRISPR/Cas系统改造而来的基因编辑技术，该技术一经问世就冲击到了生命科学研究的各个领域。CRISPR/Cas9技术依赖于sgRNA和Cas9对靶基因进行编辑，操作简便、实验周期短、应用广泛。掌握CRISPR/Cas9技术能够为以后的科学研究提供高效有力的工具。 NLRP3炎症小体是免疫系统的重要组成成分，除了与炎症疾病有关，也有研究显示NLRP3炎症小体影响癌症的发生、发展。已经有研究利用RNAi技术证明NLRP3炎症小体与乳腺癌的增殖，侵袭和转移有着相关性，但是由于RNAi技术本身的局限性，NLRP3炎症小体与乳腺癌相关性的机制还没有被阐述清楚。本研究旨在利用CRISPR/Cas9技术构建NLRP3基因稳定敲除的MDA-MB-231、MCF-7细胞株，为以后研究NLRP3炎症小体与MDA-MB-231、MCF-7细胞生长、增殖的关系奠定基础。HEK-293T细胞是常用的工具细胞，在构建NLRP3基因敲除的乳腺癌细胞株的同时，构建NLRP3基因敲除的HEK-293T细胞株，以期能够深入研究CRISPR/Cas9技术的操作要领以及为研究NLRP3炎症小体与HEK-293T细胞的关系奠定基础。 本研究利用NCBI、Uniprot网站以及sgRNA序列设计网站（http//crispr.mit.edu./）设计sgRNA，择优选择了4条sgRNA构建了4种CRISPR/Cas9重组载体。本实验用的CRISPR/Cas9系统是PX459质粒，含有嘌呤霉素抗性标记，在进行细胞转染前测定MDA-MB-231、MCF-7、HEK-293T细胞嘌呤霉素最低筛选浓度，确定MDA-MB-231的最低嘌呤霉素筛选浓度是0.6μg/mL，MCF-7的最低嘌呤霉素筛选浓度是1.5μg/mL，HEK-293T细胞的最低嘌呤霉素筛选浓度是1.5μg/mL。将CRISPR/Cas9重组质粒转染细胞，嘌呤霉素培养基筛选转染细胞，存活的细胞经过T7E1酶切验证显示获得了具有基因突变细胞的MDA-MB-231、HEK-293T混合克隆细胞。将得到的MDA-MB-231、HEK-293T混合克隆细胞通过有限稀释法和克隆形成法进行单克隆细胞培养，最后MDA-MB-231细胞得到35个单克隆细胞株，经过鉴定有2个单克隆细胞株产生了NLRP3基因的基因突变，MCF-7细胞得到了一个单克隆细胞株，经鉴定没有发生基因突变，HEK-293T细胞得到了23个单克隆细胞株，其中有12个单克隆细胞株产生了基因突变，并且有8个单克隆细胞株发生的是移码突变。本实验成功获得了NLRP3基因突变的MDA-MB-231、HEK-293T细胞株。 同时，本研究还利用与PX459质粒结构、大小相似但是含有EGFP标记的CRISPR/Cas9质粒PX458转染MDA-MB-231、MCF-7、HEK-293T细胞，通过比较三种细胞表达的荧光强度可以看出HEK-293T的转染效率远高于MDA-MB-231、MCF-7细胞的转染效率。本研究通过比较MDA-MB-231、MCF-7、HEK-293T细胞的转染效率和最终得到的NLRP3基因突变的单克隆细胞株的获得比率，推测，转染效率越高，获得基因突变的细胞株的可能性越大。这为以后利用CRISPR/Cas9技术进行科学研究的其他研究者提供研究思路。 综上所述，本论文利用CRISPR/Cas9技术构建了NLRP3基因突变的MDA-MB-231、HEK-293T细胞株，其中HEK-293T细胞得到了8株稳定的NLRP3基因敲除的细胞株。这为以后研究NLRP3炎症小体与MDA-MB-231、HEK-293T细胞之间的关系奠定了基础。

目录

声明

缩略词中英文对照表

第一章 综述

1 基因编辑技术发展历史

1.1 锌指核酸酶技术

1.2 转录激活样效应因子核酸酶技术

1.3 CRISPR/Cas技术

2 CRISPR/Cas技术的结构与机制

2.1 CRISPR/Cas系统的结构

2.2 CRISPR/Cas系统的机制

3 CRISPR/Cas系统的分类

3.3 Ⅲ型CRISPR/Cas系统

4 CRISPR/Cas9技术的应用

4.1 CRISPR/Cas9技术在细胞基因编辑中的应用

4.2 CRISPR/Cas9技术在表达调控中的应用

4.3 CRISPR/Cas9技术在动物模型建立中的应用

5 CRISPR/Cas9技术面临的问题和挑战

5.1 脱靶问题

5.2 道德伦理问题

6 NLRP3炎症小体

7 MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞和HEK-293T细胞简述

7.1 MDA-MB-231细胞

7.2 MCF-7细胞

7.3 HEK-293T细胞

8 本论文选题的依据及意义

第二章 材料与方法

1 材料

1.1 细胞系、菌株和载体

1.2 常用试剂

1.3 仪器

1.4 常用实验试剂配制

2 方法

2.1 NLRP3敲除靶点的设计

2.2 PX459重组载体的构建与鉴定

2.3 细胞转染与NLRP3基因敲除细胞株的获得

第三章 结果与讨论

1 结果

1.1 NLRP3基因敲除靶点的选择

1.2 重组载体的鉴定

1.3 MDA-MB-231、MCF-7、HEK-293T细胞转染效率的检测

1.4 嘌呤霉素筛选浓度测定

1.5 NLRP3敲除靶点打靶效率检测

1.6 PCR及测序鉴定NLRP3基因编辑情况

2 讨论

第四章 结论

参考文献

致谢