单分子荧光生物传感器的构建及其在生化分析中的应用研究

摘要

开发具有高灵敏度、高选择性和可快速定量生物分子的生物传感器对于疾病诊断和生物医学研究具有极其重要的意义。然而传统的生化分析方法通常具有操作费时、灵敏度低、特异性差等缺点。在某些情况下，例如疾病发生的早期，目标生物分子的浓度常常太低而不能通过这些常规方法检测，往往需要繁琐的程序来提高检测灵敏度。因此，迫切需要开发更加简单和超灵敏的生化分析方法用于低浓度靶标的定量检测。单分子荧光检测方法可以很好地满足上述需求，在开发超灵敏生物传感器中极具潜力，通过用适当的荧光团标记靶标生物分子，即可实现单分子水平上对靶生物分子进行定量检测。与传统的荧光系综检测方法相比，基于单分子检测的生化分析方法具有超高灵敏度、良好选择性、快速分析时间和低样品消耗等显著优点，被视为一种可快速且简单地定量低浓度生物分子的理想方法。本论文基于单分子荧光检测技术，结合先进的生化分析方法，开发了一系列具有良好性能的单分子荧光生物传感器，并将其用于多种生物分子的定量分析，例如酶、核酸及活细胞等。具体研究内容包括： （1）构建了一种基于分子信标功能化量子点的单分子荧光生物传感器用于DNA甲基转移酶活性检测。细胞中异常的DNA甲基转移酶活性与人类疾病发展密切相关，发展可用于DNA甲基转移酶活性准确和灵敏检测的生物传感器对疾病诊断和药物开发具有重要意义。然而，目前已报道的DNA甲基转移酶活性检测方法通常操作复杂且灵敏度较低。在本章节中，我们发展了一种分子信标功能化量子点的单分子荧光生物传感器用于DNA甲基转移酶活性检测。本方法采用了淬灭剂/荧光团（BHQ2/Cy5）双标记的分子信标作为检测探针，并将其组装在量子点（605QD）表面形成605QD/探针/BHQ2/Cy5纳米复合物。在这一纳米结构中，源自605QD和Cy5之间的荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）信号被BHQ2所淬灭。在靶标DNA腺嘌呤甲基转移酶Dam作用下，检测探针被特异性甲基化，随后被对DNA甲基化敏感的限制性内切核酸酶DpnI切割，导致BHQ2分子从检测探针中释放，从而恢复FRET信号，并通过基于全内反射荧光（Total internal reflection fluorescence,TIRF）成像的单分子计数方法进行检测。该生物传感器仅需要单个检测探针即可实现DNA甲基转移酶活性的有效检测，无需复杂的方案设计和繁琐信号放大步骤。同时，该检测方法具有高选择性和高灵敏度，检出限达到0.002U/mL。此外，该生物传感器还可以进一步应用于DNA甲基转移酶抑制剂的筛选，在疾病诊断和药物开发中具有重要的潜在应用价值。 （2）发展了一种基于连接扩增反应组装的单个量子点荧光生物传感器用于碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性检测。ALP在多种细胞内生理和病理过程中起重要作用，发展可用于ALP活性检测的方法对于基础生物学研究和临床诊断都是非常重要的价值。在多种检测方法中，荧光法是应用最广泛的ALP检测方法。然而，它们往往需要繁复的程序制备无机纳米材料和有机小分子探针。更重要的是，由于缺乏适当的信号放大技术，这些荧光方法的检测灵敏度不足以检测低浓度的靶标。为了解决这些问题，我们发展了一种基于连接扩增反应组装的单个量子点荧光生物传感器用于定量检测ALP活性。与常用的非核酸ALP底物相比，我们采用3'-磷酸化探针将酶活性信号转化为易于扩增的核酸信号。ALP能催化3'-磷酸化探针的去磷酸化，并使之在模板的存在下与辅助链连接。连接后的探针/辅助链可作为二级模板，通过循环的连接酶扩增反应催化形成多个Cy5/biotin双标记的信号探针。这些信号探针可组装在量子点605QD表面，形成605QD/Cy5纳米复合物，导致FRET发生，信号可通过单分子荧光方法检测。该生物传感器具有高敏度，检测限为5.63×10-8U/mL，并且无需复杂的材料与小分子探针化学合成步骤。同时，这一方法还能够从细胞提取物中定量检测内源ALP活性，检测限为1个细胞，并且可以区分不同细胞系的ALP表达水平。该生物传感器还可进一步用于ALP酶动力学分析和ALP抑制实验，为ALP相关的生物医学研究和临床诊断应用提供了新方法。 （3）开发了一种基于无酶催化自组装的单个量子点荧光纳米传感器用于循环microRNA检测。微小RNA（microRNA）是基因表达的关键调节因子，并且可作为潜在生物标志物用于临床疾病诊断。然而，目前的microRNA测定方法通常较为繁琐且灵敏度较低，不适于检测低浓度靶标如血液中的循环microRNA。为了提高检测灵敏度，最常用的方法是酶辅助的核酸信号扩增，但它们需要昂贵且不稳定的酶、精确的热循环和复杂的方案设计。在本章节中，我们发展了一种基于无酶催化自组装的单个量子点荧光纳米传感器用于循环microRNA检测。本方案中，microRNA的存在可催化两个发夹DNA探针的循环杂交，包括生物素标记的捕获探针和Cy5标记的检测探针，形成生物素/Cy5双标记的DNA双链体。这些双链体可组装在链霉亲和素修饰的量子点605QD表面，诱导FRET发生，信号可以通过基于全内反射荧光成像的单分子荧光方法检测。该生物传感器具有高选择性和灵敏度，检测限低至8.16×10-16M，可用于准确检测细胞内源microRNA和人血液样中的循环microRNA。 （4）报道了一种基于DNA纳米机器的单分子荧光生物传感器用于循环肿瘤细胞检测。开发可以对稀有癌细胞如循环肿瘤细胞进行准确和灵敏检测的方法具有重要的临床诊断和癌症生物医学研究价值。然而，目前大多数存在的癌细胞检测方法通常灵敏度不足且操作复杂。在本章节中，我们构建了一种新的基于DNA纳米机器的单分子荧光生物传感器用于循环肿瘤细胞检测。该DNA纳米机器由三种DNA组分构成，包括检测探针、信号探针和燃料序列。在与靶标癌细胞结合后，检测探针经历构象转换暴露出可与信号探针杂交的toehold位点，从而启动级联DNA链置换反应，激活DNA纳米机器并释放大量Cy5标记的报告序列，最后通过基于全内反射荧光成像的单分子荧光检测对Cy5信号进行定量检测。该测定使用熵驱动的DNA纳米机器进行有效的癌细胞识别和信号扩增，无需昂贵且不稳定的抗体和酶，并且它能够以高灵敏度和良好的特异性对癌细胞进行一步检测。此外，它还可以应用于人血液样品中稀有的循环肿瘤细胞进行定量检测。

目录

声明

第一章 绪论

1.1单分子荧光方法简介

1.2单分子荧光生物传感器研究进展

1.2.1分离技术辅助的单分子荧光生物传感器

1.2.2无需分离的单分子荧光生物传感器

1.3本论文选题的目的及意义

参考文献

第二章 基于分子信标功能化量子点的单分子荧光生物传感器用于DNA甲基转移酶活性检测

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1材料

2.2.2发卡结构检测探针的制备

2.2.3探针的甲基化与切割反应

2.2.4量子点纳米结构的组装

2.2.5聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2.6荧光测量

2.2.7单分子荧光检测及数据分析

2.2.8抑制剂分析实验

2.2.9血清样品中DNA甲基转移酶的检测

2.3结果与讨论

2.3.1 DNA甲基转移酶检测原理

2.3.2可行性分析

2.3.3 实验条件优化

2.3.4灵敏度分析

2.3.5特异性分析

2.3.6回收率分析

2.3.7抑制剂筛选

2.4结论

参考文献

第三章 基于连接扩增反应组装的单个量子点荧光生物传感器用于碱性磷酸酶活性检测

3.1引言

3.2材料方法

3.2.1材料

3.2.2 ALP催化的去磷酸化

3.2.3连接扩增反应

3.2.4量子点纳米结构的组装

3.2.5荧光测量

3.2.6单分子检测和数据分析

3.2.7凝胶电泳

3.2.8 ALP抑制剂分析实验

3.2.9细胞提取物的制备

3.3结果与讨论

3.3.1 ALP检测原理

3.3.2可行性分析

3.3.3实验条件优化

3.3.4灵敏度分析

3.3.5酶活动力学检测

3.3.6特异性分析

3.3.7抑制剂筛选

3.3.7实际样品检测

3.4结论

参考文献

第四章 基于无酶催化自组装的单个量子点荧光纳米传感器用于循环microRNA检测

4.1引言

4.2材料方法

4.2.1材料

4.2.2发卡结构探针的制备

4.2.3 MiR-21催化的量子点自组装反应

4.2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳

4.2.5荧光测量

4.2.6单分子荧光检测及数据分析

4.2.7 qRT-PCR检测

4.2.8细胞培养及RNA提取

4.3结果与讨论

4.3.1 microRNA检测原理

4.3.2可行性分析

4.3.3试验条件优化

4.3.4灵敏度分析

4.3.5 特异性析

4.3.6 qRT-PCR定量检测

4.3.7 细胞中microRNA检测

4.3.8血液中循环microRNA检测

4.4结论

参考文献

第五章 基于DNA纳米机器的单分子荧光生物传感器用于循环肿瘤细胞检测

5.1引言

5.2材料方法

5.2.1材料

5.2.2细胞培养

5.2.3癌细胞检测

5.2.4荧光测量与凝胶成像

5.2.4循环肿瘤细胞检测

5.3结果与讨论

5.3.1肿瘤细胞检测原理

5.3.2可行性分析

5.3.3特异性分析

5.3.4灵敏度分析

5.3.5 稳定性分析

5.3.6普适性分析

5.3.7循环肿瘤细胞检测

5.4总结

参考文献

攻读博士学位期间的学术成果

致谢