槐定碱对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞CD14、P38MAPK及iNOS表达的影响

摘要

目的:观察槐定碱（sophoridine,SRI）对脂多糖（LPS）诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞表面受体CD14、胞内信号转导分子p38MAPK、iNOS及炎症介质TNF-α、NO表达的动态变化，探讨槐定碱抗内毒素性炎症反应的机制。
　　方法:用LPS刺激RAW264.7巨噬细胞，建立细胞炎症反应模型，实验细胞分为8组（n=6）：空白对照组、LPS模型1组、LPS模型2组、槐定碱干预组、槐定碱预处理组、槐定碱预混合组、SB203580组、SB203580+槐定碱干预组。槐定碱剂量15.63mg?L-1。MTT法测定槐定碱最大无毒浓度（TC0）；反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测RAW264.7巨噬细胞CD14、p38及iNOSmRNA表达；Westernblot技术检测RAW264.7巨噬细胞CD14、p-p38及iNOS蛋白的表达；硝酸还原酶法测定细胞培养液一氧化氮（NO）含量；放射免疫分析法检测细胞培养液肿瘤坏死因子（TNF-α）含量。
　　结果:（1）ReedMuench法计算槐定碱对RAW264.7巨噬细胞的TC0=200mg*L-1。
　　（2）与空白对照组比较，LPS模型1组各时间点CD14、p38、iNOSmRNA与CD14、p-p38、iNOS蛋白表达均显著增高（P<0.01）；槐定碱干预组各时间点CD14、p38、iNOSmRNA与CD14、p-p38、iNOS蛋白表达多低于同时间点LPS模型1组（P<0.01或P<0.05），但仍高于空白对照组（P<0.01）；SB203580组各时间点iNOSmRNA与蛋白表达均低于同时间点LPS1组（P<0.05或P<0.01）；SB203580+槐定碱干预组iNOSmRNA与蛋白表达量多低于同时间点SB203580组（P<0.05或P<0.01）。
　　（3）与空白对照组比较，LPS模型2组各时间点CD14、p38、iNOSmRNA与CD14、p-p38、iNOS蛋白表达均显著增高（P<0.01），并随LPS刺激时间延长表达呈升高趋势，至120min未见下降（P<0.01）；与LPS2组比较，槐定碱预处理组同时间点p38、iNOSmRNA表达量及CD14、p-p38、iNOS蛋白表达量均降低（P<0.01或P<0.05），但仍高于空白对照组（P<0.01）；与LPS2组比较，槐定碱预混合组同时间点CD14、p38、iNOSmRNA及CD14、p-p38、iNOS蛋白表达量均降低（P<0.01或P<0.05），但均高于空白对照组（P<0.01）。
　　（4）LPS1组各时间点NO、TNF-α释放量均显著高于空白对照组（P<0.01）；与LPS1组比较，槐定碱干预组各时间点NO、TNF-α释放量均低于同时间点LPS1组（P<0.05或P<0.01），且NO、TNF-α释放量随槐定碱干预时间的延长而逐渐降低，至120min时均已接近空白对照组水平（P>0.05）；SB203580组各时间点NO、TNF-α释放量均低于同时间点LPS1组（P<0.05或P<0.01）；SB203580+槐定碱干预组NO、TNF-α释放量多低于同时间点SB203580组（P<0.05或P<0.01），至120min时均已接近空白对照组水平（P>0.05），表明槐定碱干预LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO、TNF-α具有时间依赖性。
　　（5）与LPS1组比较，槐定碱31.25mg*L-1、15.63mg?L-1剂量干预组均可下调NO、TNF-α释放量（P<0.05或P<0.01），随着槐定碱剂量降低（7.82mg*L-1、3.91mg*L-1、1.95mg*L-1），NO、TNF-α的释放量呈上升趋势，且与LPS1组无显著差异（P>0.05）；SB203580组NO、TNF-α释放量均低于LPS1组（P<0.01）；SB203580+槐定碱31.25mg*L-1、15.63mg?L-1剂量干预组NO、TNF-α释放量均低于SB203580组（P<0.05或P<0.01），并随槐定碱剂量的降低（7.82mg*L-1、3.91mg*L-1、1.95mg*L-1）NO、TNF-α的释放量呈上升趋势，并与SB203580组无显著差异（P>0.05）；表明槐定碱干预LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO、TNF-α具有剂量依赖性。
　　结论:（1）ReedMeuench法计算槐定碱对RAW264.7巨噬细胞的TC0=200mg?L-1。
　　（2）槐定碱抗内毒素效应与其下调LPS诱导的CD14、p38、iNOS的转录、翻译及蛋白磷酸化水平及直接拮抗内毒素作用有关。
　　（3）槐定碱抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞释放NO、TNF-α的效应具有时间依赖性和剂量依赖性。
　　（4）槐定碱可协同SB203580抑制LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS的表达及NO、TNF-α的释放，表明槐定碱还可通过干预p38MAPK途径外的其它信号通路抑制LPS诱导的炎症因子表达。

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中英文缩略词表

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前 言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

结 果

1 槐定碱对RAW264.7巨噬细胞TC0的测定

2 槐定碱对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞CD14 mRNA及蛋白表达的影响

3 槐定碱对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞p38 mRNA及p-p38蛋白表达的影响

4 槐定碱对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞iNOS mRNA及蛋白表达的影响

5 槐定碱干预对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞释放NO的影响

6 槐定碱干预对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞释放TNF-α的影响

讨 论

1 槐定碱对RAW264．7巨噬细胞TC0的测定

2 槐定碱对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞CD14 mRNA及蛋白表达的影响

3 槐定碱对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞p38 mRNA及p-p38蛋白表达的影响

4 槐定碱对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞iNOS mRNA及蛋白表达的影响

5 槐定碱对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞释放NO、TNF-α的影响

结 论

附 图

参考文献

文献综述

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文