马铃薯Y病毒山东分离物株系鉴定及其外壳蛋白基因的克隆

摘要

马铃薯在生长期中受各种病毒病的为害而造成质量和品质的下降.通过植物抗病毒基因工程进行作物育种是防治病毒病害最经济有效的方法.在抗病毒基因工程所应用的转基因中,利用病毒外壳蛋白基因为转基因是较为成熟的抗病毒育种策略.在对转病毒外壳蛋白基因植株进行抗病性鉴定时发现,转病毒外壳蛋白基因的转基因植物的抗病机制是RNA介导的,其中RNA介导的植物抗病毒策略由于具有更安全有效的优点而成为植物抗病毒基因工程领域研究的热点.

目录

文摘

英文缩略表

1.引言

1.1 马铃薯Y病毒属病毒与植物互作的分子生物学研究进展

1.1.1 基因组的结构与表达

1.1.2系统侵染

1.1.3 病毒的传播

1.1.4 植物的症状表现及对病毒的抗性

1.2 植物抗病毒基因工程研究进展

1.2.1 利用病毒来源的基因获得抗病毒转基因植株

1.2.2 利用非病毒来源的基因获得病毒抗性

1.3 转基因植物中RNA介导的病毒抗性

1.3.1 RNA介导的病毒抗性的特点

1.3.2 RNA介导抗性的分子基础

1.4 马铃薯抗病毒基因工程研究进展

1.4.1 病毒来源的马铃薯转基因研究情况

1.4.2 非病毒来源的马铃薯抗病毒基因工程研究进展

1.5 本研究的立论依据和主要研究内容

2. 材料与方法

2.1材料

2.1.1 供试植物病毒

2.1.2 供试植物

2.1.3 供试传毒介体

2.1.4 实验菌株与克隆载体质粒

2.1.5 PCR引物

2.1.6 酶、试剂及仪器

2.1.7 培养基

2.2 方法

2.2.1 马铃薯Y病毒山东分离物生物学特性的研究及株系鉴定

2.2.2 马铃薯Y病毒的提纯

2.2.3 病毒粒体组织超薄切片观察

2.2.4 马铃薯Y病毒RNA的提取

2.2.5 在含有甲醛的凝胶上进行电泳

2.2.6 SDS-PAGE检测病毒外壳蛋白亚基的分子量

2.2.7 马铃薯Y病毒抗血清的制备

2.2.8 免疫球蛋白的纯化

2.2.9 ELISA检测方法

2.2.10 马铃薯Y病毒山东分离物外壳蛋白基因的克隆

2.2.11 免疫型转基因烟草对PVYN和PVY-SD抗病性比较

2.2.12 山东省内马铃薯上马铃薯Y病毒田间发病率调查

3. 结果与分析

3.1 马铃薯Y病毒山东分离物生物学特性的研究

3.1.1 病毒分离物的获得

3.1.2 寄主范围的测定

3.1.3 病毒分离物体外抗性的测定

3.1.4 蚜虫传毒特性的研究

3.2 病毒的提纯和粒体大小

3.3 病毒粒体超薄切片观察

3.4 病毒RNA的提取

3.5RNA甲醛变性凝胶电泳

3.6 SDS-PAGE测定病毒外壳蛋白亚基的分子量

3.7 PVY抗血清纯化的免疫球蛋白工作浓度的选择

3.8 PVY抗血清对烟草病汁液灵敏度测定

3.9 RT-PCR扩增PVY外壳蛋白基因

3.10 质粒pUC19与RT-PCR扩增目的片段的酶切电泳

3.11 外源DNA与质粒在载体的连接及向大肠杆菌中的转化

3.12 重组质粒的酶切鉴定

3.13 cDNA的序列测定

3.14 PVY-SDCP基因序列与已报道的PVY的CP基因同源性比较

3.15 PVY系统树的绘制

3.16 T0代免疫型转基因烟草植株对PVYN和PVY-SD抗病性比较

3.17 马铃薯Y病毒田间带毒率的调查

4. 讨论

4.1 马铃薯Y病毒山东分离物(PVY-SD)株系鉴定

4.2 关于马铃薯Y病毒的提纯问题

4.3 马铃薯Y病毒及其检测技术

4.4 PVY-SD外壳蛋白基因的克隆和序列分析

4.5 T0代免疫转基因烟草植株对PVYN和PVY-SD抗病性比较

4.6 对山东省马铃薯田间PVY带毒率的初步调查

5. 结论

参考文献

附录

致谢