棉花液泡型Na/H逆向运转体基因的克隆、功能鉴定及其在耐盐性中的重要作用

摘要

植物液泡型Na<'+>/H<'+>逆向运转体利用液泡膜H<'+>-ATPase(V-ATPase)和液泡膜H<'+>-PPiase(V-PPiase)产生的跨膜质子电化学梯度将液泡基质中质子顺电化学梯度运出液泡,同时将胞质中的Na+逆浓度梯度运入液泡内积累.这不仅能够降低胞质内的Na<'+>以维持胞质正常的K<'+>/Na<'+>比值,还可以有效利用储存在液泡中的Na<'+>作为渗透剂.过量表达液泡型Na<'+>/H<'+>逆向运转体的转基因拟南芥、番茄等的耐盐性明显提高,说明液泡型Na<'+>/H<'+>逆向运转体在植物的耐盐性中有重要作用.虽然棉花是较耐盐碱的作物之一,在盐碱地区有大面积种植,已取得良好的经济效益和社会效益.但棉花的耐盐能力仍然有限,常规品种一般耐盐能力只有0.3％.所以,要在盐碱地广泛种植棉花,必须进一步提高棉花的耐盐能力.国内外在这方面做了大量研究.然而涉及分子水平的研究还不多,对Na<'+>在棉花液泡内的积累与否还有争议.因此该研究分别以耐盐棉花品种枝棉3号(ZM3)和盐敏感品种中棉所12号(ZMS12)、中棉所17号(ZMS17)为试材,对棉花液泡型逆向运转体进行基因克隆、序列比较、表达分析和功能鉴定,并对其与棉花不同品种的耐盐性关系进行了初步研究.

目录

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1.引言

1.1植物的耐盐性

1.1.1盐胁迫对植物的危害

1.1.2 Na+毒性的主要基础

1.1.3植物的盐胁迫适应机制

1.1.4盐胁迫信号途径

1.2棉花的耐盐性

1.2.1棉花的耐盐机制

1.2.2棉花耐盐性育种进展

1.3本研究的目的及意义

2.材料与方法

2.1材料

2.1.1植物材料

2.1.2植物材料培养与处理

2.1.3酵母菌株和载体

2.1.4原核表达载体和菌株

2.1.5实验引物

2.1.6其他材料

2.2实验方法

2.2.1 RNA提取

2.2.2 RNA纯化

2.2.3 cDNA第一条链的合成

2.2.4 cDNA全长序列的获得

2.2.5 DNA片段与克隆载体的连接

2.2.6大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.7大肠杆菌细胞的转化

2.2.8序列测定

2.2.9质粒DNA的提取

2.2.10电泳凝胶中DNA片段的回收

2.2.11 Northern杂交

2.2.12 Southern杂交

2.2.13酵母表达载体的构建与转化

2.2.14植物表达载体的构建与转化

2.2.15原核表达及抗体制备

2.2.16生理指标的测定

3.结果与分析

3.1棉花液泡型逆向运转体基因的分离、表达分析及功能鉴定

3.1.1棉花液泡型逆向运转体基因的分离

3.1.2 GhNHX1的序列分析

3.1.3棉花液泡型逆向运转体基因的表达分析

3.1.4棉花GhNHX1基因的功能鉴定

3.2棉花不同棉花品种的耐盐性分析

3.2.1盐胁迫对不同棉花品种的叶绿素(Chl)和丙二醛(MDA)含量的影响

3.2.2盐胁迫处理后不同棉花品种的离子含量的差异

3.2.3 GhNHX1在不同棉花品种中的诱导表达

3.3 GhNHX1的原核诱导表达和抗体制备

4.讨论

4.1 GHNHX1编码一种液泡型Na+/H+逆向运转体

4.2 GHNHX1可能的信号机制

4.3棉花不同品种的耐盐性差异与GhNHX1的关系

4.4融合蛋白的原核表达和培养条件对表达产量的提高

5.结论

参考文献

附录

致谢