农杆菌介导小麦成熟胚遗传转化体系的建立及转抗虫基因小麦分析

摘要

小麦是重要的粮食作物，利用植物基因工程技术进行小麦遗传改良，增强小麦抗病虫和耐逆境能力，提高产量，改善品质，是小麦遗传育种的一个新的方向。本研究以27份优良普通小麦(TriticumaestivumL.)主栽品种或高代育种品系，以及4份二倍体和四倍体小麦为试材，进行成熟胚愈伤组织诱导及分化再生的培养，比较其诱导及分化再生能力，研究影响愈伤组织形成及分化再生的因素(基因型、诱愈方式、2,4-D、ABA及KT浓度等)，筛选小麦成熟胚愈伤组织诱导及分化再生能力强的基因型，建立小麦成熟胚植株再生体系。对筛选出来的适合小麦成熟胚组织培养的基因型，利用建立的成熟胚植株再生体系，采用农杆菌(GV3101/pBI121：：gus)介导对小麦成熟胚及愈伤组织进行遗传转化，并对影响遗传转化效率的因素(转化受体的基因型、负压处理、侵染菌液的浓度、外植体预培养时间、侵染时间等)进行研究，确定选择剂的选择压力。同时，对以本实验室选育的小麦优良品系山农995604的胚性愈伤组织为材料，采用农杆菌介导将抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI转入小麦培养细胞，经筛选获得的抗卡那霉素再生植株，进行PCR和实时PCR以及PCR-Southern和Southernblot检测，并进行转化植株后代的CpTI基因遗传分析和抗虫鉴定。获得以下主要结果： 1.小麦的基因型、成熟胚愈伤组织诱导方式、诱愈时的温度、光照、诱愈培养基2,4-D和ABA浓度及分化培养基KT浓度等，是影响小麦成熟胚愈伤组织形成和分化再生的重要因素。应用剥胚法(embryo-isolatedmethod，EI)和整粒法(endosperm-supportedmethod，ES)诱导成熟胚愈伤组织，并分别进行分化再生培养，在31份小麦品种(系)中筛选出了愈伤组织诱导率高、质量好、分化再生能力强、成苗率高的12个基因型，确定了每一基因型的最佳诱愈和分化再生途径，30～35d即可获得大量再生植株。适合于剥胚诱愈的有TS021(分化培养基为MSF5)、HB188(MSF5)、SN2618(MSF5)、HB215(MSF5)、Yumai54(MSF5)、T9817(MSF5)、T.dicoccum(MSF5)和SN03J102(MSF9)；适合于整粒法的有4072(MSF1)、TS021(MSF3)、Yannong19(MSF3)、HB341(MSF3)、Jinghua1(MSF5)。在此基础上建立了较为优化和快捷的小麦成熟胚愈伤组织诱导及分化再生体系，为小麦遗传转化的成功奠定了基础。 2.接种茵液浓度及侵染时间、外植体预培养时间、负压处理、转化受体的基因型等因素，对小麦成熟胚遗传转化有较大影响。不同基因型的转化受体，对相同农杆菌菌株有不同的敏感性；在进行接种侵染时，同时实施适当的负压处理有助于提高转化效率；以整粒切割的成熟胚为受体的转化，效率明显高于以成熟胚愈伤组织为受体的遗传转化；确定了最佳接种菌液浓度及侵染时间和选择剂的选择压力；在短时间(30～35d)内即可获得转化苗，最高转化率可达12.5％。以上研究结果，证明了以成熟胚为外植体源进行小麦遗传转化的可行性和有效性，并初步建立了较为优化的农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化体系。 3.采用农杆菌介导法获得的3株独立的抗卡那霉素再生植株经过分子检测，为转CpTI基因小麦植株，CpTI基因以单拷贝形式插入到这些转化小麦基因组的不同位点。3株转基因小麦正常可育，形成转基因株系。CpTI基因在转基因小麦T1代中的分离呈多样性，在转基因株系T-Ⅰ、T-Ⅲ中CpTI基因按照孟德尔3：1分离比进行遗传；而在转基因株系T-Ⅱ中，CpTI基因的遗传不符合孟德尔规律。抗虫试验表明，3个转基因株系对储粮害虫麦蛾的抗性有很大提高。转基因株系T-Ⅰ、T-Ⅱ、T-Ⅲ的T1代PCR阳性植株所结实的T2代籽粒及阴性对照非转基因植株籽粒，虫蛀率分别为19.77％、21.86％、32.87％和58.27％，每一株系与对照相比都具有极显著性差异，麦蛾虫蛀率分别下降了66.07％、62.48％、43.59％。转基因小麦抗麦蛾能力的增强，极大程度上是由于CpTI基因导入到小麦基因组中的缘故，而非来源于组织培养效应。外源目的基因CpTI基因及有关DNA片段的导入并没有增加转化小麦植株对蚜虫的抵御能力。本研究获得的转抗虫基因小麦株系可进一步用于小麦抗虫新品系的选育，为小麦遗传改良提供了新的抗虫种质材料。伴随着转基因小麦的产生，形成了一些农艺性状发生变化的体细胞无性系变异株系，为小麦育种提供了新的种质资源。

目录

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本论文主要缩写词及中英文对照

第一章文献综述

1.1利用基因工程技术进行植物遗传改良

1.2植物抗虫基因工程

1.3小麦遗传转化研究进展

1.4本研究的目的和意义

第二章农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化体系的建立

第三章农杆菌介导抗储粮害虫转基因小麦的分析

第四章讨论与结论

参考文献

图版

致谢

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后记