SARS冠状病毒非结构蛋白Nsp14基因的克隆表达及其作用底物的制备

摘要

本研究通过对SARS冠状病毒非结构蛋白Nsp14基因进行克隆，原核表达得到了Nsp14蛋白，并为Nsp14蛋白功能的检测制备了底物。 试验一、SARS冠状病毒非结构蛋白Nsp14基因的克隆。根据Genebank公布的SARS冠状病毒非结构蛋白Nsp14的基因序列设计引物，用PCR的方法把Nsp14基因从SARS冠状病毒的cDNA片段中扩增出来，将目标基因连接到原核表达载体(pET30a)中，构建重组质粒。重组质粒经PCR和酶切反应进行了初步鉴定，并将初步鉴定后的质粒进行测序。测序结果表明，克隆的Nsp14基因序列与发表基因完全一致，成功构建了原核表达载体pET30a-Exo。 试验二、对非结构蛋白Nsp14进行了诱导表达和纯化。把构建的原核表达载体pET30a-Exo转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导产物经SDS-PAGE电泳后，发现目的蛋白以包涵体的形式存在。对非结构蛋白Nsp14的表达和纯化条件进行了优化。使用多步洗涤的方法对包涵体进行了初步纯化，使用稀释法对包涵体进行了重新折叠，使用镍柱纯化的方法对重折叠后的产物进一步纯化，SDS-PAGE电泳结果表明：得到了纯度较高的非结构蛋白Nsp14。 试验三、对非结构蛋白Nsp14作用底物进行制备。通过转录得到了RNA，得到了非结构蛋白Nsp14作用底物。

目录

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引言

实验研究部分

试验一、SARS冠状病毒非结构蛋白Nspl4基因的克隆

试验二、SARS冠状病毒非结构蛋白Nspl4的表达与蛋白纯化

试验三、SARS冠状病毒非结构蛋白Nspl4作用底物的制备

讨论

结论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士期间发表论文