番茄抗性缺失突变体spr6的鉴定与基因克隆

摘要

在长期的进化过程中，高等植物为了抵抗昆虫的侵害，建立起了复杂、多样的抗性反应机制。从总体上讲，植物对昆虫的抗性可分为组成型抗性和诱导型抗性两种类型。所谓诱导型抗性是指植物受到昆虫侵害后，迅速合成一系列对昆虫有毒性的化学物质而对昆虫的进食、消化吸收、生长发育和繁殖等活动产生抑制作用，从而达到抗虫的目的。诱导型抗性是植物自身所产生的一种更为主动、更为经济有效的抗性反应方式，具有重要的理论研究意义和实际应用价值。深入认识植物对昆虫抗性的分子机理将会为利用植物自身的抗性建立环境友好的控制农业害虫的策略提供理论依据。这一策略是我国乃至世界农业的迫切要求和发展趋势。要达到这一目标，就必须对植物自身的抗性反应机理进行深入透彻的研究。 就植物对昆虫抗性反应机理而言，番茄被认为是研究植物从受伤刺激到抗性基因表达这一信号传导过程的最理想的模式系统。这主要是因为番茄中存在衡量抗性反应强弱的标志蛋白——蛋白酶抑制剂(Proteinaseinhibitors，PIs)。蛋白酶抑制剂是一类富含丝氨酸的小分子量碱性蛋白质分子，通过抑制昆虫体内消化酶的活性而达到抗虫的目的。 本实验室以前人多年的研究工作为基础，以番茄为模式系统，利用抗虫机理研究透彻的PIs作为衡量抗性强弱的生化标记来筛选番茄抗性缺失突变体，从而建立了用正向遗传学的思路和方法解析植物对昆虫抗性反应机制的研究体系。前期工作证明植物激素茉莉酸作为一种可以长距离运动的信号分子在植物对昆虫侵害的系统性抗性中起核心调控作用。为了获得在这一系统素/茉莉酸信号途径中更多的新组分，本研究对原有的遗传筛选体系从基础材料和筛选指标两方面进行了改进，使之适合从全基因组范围内大规模鉴定番茄抗性缺失突变体。以组成型表达PIs的转基因番茄35S．:PS为基础材料，利用甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)进行化学诱变，采用多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)染色与PIs鉴定相结合的方法筛选番茄抗性缺失突变体，从而大大提高了遗传筛选的效率。 本研究中的spr6是新获得的番茄抗性缺失突变体，机械受伤和外施系统素不能诱导蛋白酶抑制剂ⅡⅢ(PI-Ⅱ)的表达，但茉莉酸能够以剂量依赖的方式诱导PI-Ⅱ的表达，这意味着该突变体在番茄伤害信号途径中起到重要作用，并且该突变体可能是一类茉莉酸合成突变体；将该突变体spr6和抑制的茉莉酸合成突变体杂交结果显示，spr6和所有已知的合成突变体(defl、spr2和acxl/JLl)都不等位。我们由此推断该突变体spr6编码一个与茉莉酸合成或者合成调控有关的新基因。为了验证突变是否影响了JA的合成，我们对spr6中JA含量通过GC-MS测定，在未受伤的突变体和野生型番茄中JA含量分别为85±21ng(g FW)<'-1>和95±34ng(gFW)<'-1>；受伤处理后两者的JA含量分别为360±22ng(g FW)<'-1>和460±36ng(g FW)<'-1>。突变体中的JA含量大约是野生型中的78％。这说明突变并没有影响JA的基础含量，但是部分破坏了受伤诱导的JA的积累。遗传学研究证明，在spr6的F2分离群体中对其单株PI-Ⅱ积累水平进行分析，有受伤反应的单株和没有反应的单株分别为89株和34株，符合3：1的分离比(x<'2>=1.11)，这说明spr6受伤诱导的PI-Ⅱ表达的缺失是由单隐性基因突变造成的。利用图位克隆技术将相应基因印Spr6定位在第5号染色体IL5-3相应区段，通过候选基因法策略证明Spr6基因是LeCOll基因单碱基突变形成的一个等位基因。通过RT-PCR得到spr6纯合系和野生型番茄WT的LeCOll全长cDNA。DNA序列测定和比对显示，Spr6基因是在LeCOll基因的编码区第1254个碱基位置发生了G<,1254>→T的单碱基替换所致。这一突变在蛋白质水平上表现为该位置相应的第418个氨基酸Leu<,418>(亮氨酸)替换为Phe(苯丙氨酸)。spr6突变体育性正常为研究茉莉酸信号传导提供了一个非常有价值的工具。 本研究中Spr6基因的快速分离证明了基于遗传连锁分析的候选基因法策略的成功，而且随着更多的系统素/茉莉酸信号途径相关基因/突变位点在番茄遗传连锁图上被定位，这方面的优势会更加明显。