NDV F基因和胸腺五肽基因真核共表达质粒的构建与应用

摘要

核酸疫苗是通过基因重组手段将编码某种抗原蛋白质的基因与载体重组后直接导入动物体内，在宿主体内表达抗原从而引起机体免疫应答的新型疫苗，是一种与传统疫苗截然不同的新型疫苗，被誉为第三代疫苗。新城疫(ND)一直是危害我国养禽业的重要病毒性传染病，虽然预防这种疫病的弱毒疫苗早已研制成功并得到广泛应用，但由于受母源抗体等因素的干扰，常常发生免疫失败。核酸疫苗的诞生，给基因治疗和免疫学领域带来了不可估量的前景。它可诱导细胞免疫并可抵抗母源抗体干扰，但核酸疫苗在诱导免疫应答中的效率还相对较低，影响了它的实际应用。近几年来，胸腺五肽作为一种免疫调节剂，已被广泛应用于医学临床，在兽医临床的防治试验中也取得了一定的效果。为了进一步加强NDV核酸疫苗的免疫功效，本论文进行了胸腺五肽基因与NDV F基因真核共表达质粒的构建及其免疫原性检测的研究。 本论文根据GeneBank收录的新城疫病毒(NDv)F基因序列，设计一对特异性引物，其中上游引物含有胸腺五肽(Thymopentin，TP-5)的基因序列。以NDV Z株F基因的重组质粒为模板，进行PCR扩增，其产物与真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO重组，阳性克隆经PCR扩增和核酸内切酶酶切鉴定准确无误，核酸序列测定结果与原始基因比较，同源性>99％，启始密码子和终止密码子未出现变异，将该重组质粒命名为pcDNATP-5NDVZF。将pcDNATP-5NDVZF在脂质体作用下转染CEF细胞，用间接免疫荧光试验(IFA)检测，结果证明pcDNATP-5NDVZF可在CEF细胞中大量表达F蛋白。 将NDV核酸疫苗pcDNATP-5NDVZF，pcDNANDVZF分别肌注小鼠及含有母源抗体的1日龄商品代雏鸡，进行动物免疫和攻毒保护试验，结果表明pcDNATP-5NDVZF诱导的免疫反应显著强于pcDNANDVZF，说明共表达胸腺五肽基因可增强机体对DNA疫苗的免疫反应。试验还显示核酸疫苗能够不受母源抗体干扰，诱导雏鸡的免疫反应。

目录

论文说明：缩略语英汉对照表

声明

引言

1.1核酸疫苗及其免疫机制研究进展

1.1.1核酸疫苗的发展简史

1.1.2核酸疫苗的作用机理

1.1.3影响核酸疫苗免疫效果的主要因素

1.1.4核酸疫苗的优点

1.1.5核酸疫苗的安全性问题

1.1.6核酸疫苗的前景

1.2胸腺五肽的研究与应用

1.2.1胸腺激素的研究概况

1.2.2胸腺五肽的发现

1.2.3胸腺五肽的治疗学基础

1.2.4胸腺肽的临床应用

试验一NDV F基因和胸腺五肽基因真核共表达质粒的构建

2.1材料

2.1.1菌种和质粒

2.1.2主要试剂

2.1.3琼脂糖电泳相关溶液

2.1.4质粒提取相关溶液

2.1.5 DNA片断纯化试剂盒

2.1.6载体

2.2方法

2.2.1含有NDV F基因的重组质粒DNA的构建

2.2.2重组真核表达质粒的鉴定

2.2.3重组真核表达质粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF)

2.3结果与分析

2.3.1胸腺五肽F基因真核表达质粒的构建

2.3.2转染细胞中pcDNATP-5NDVZF表达蛋白的检测结果

2.4讨论

试验二新城疫病毒核酸疫苗pcDNATP-5NDVZF在动物体内免疫功效的鉴定

3.1材料

3.1.1试验动物

3.1.2 NDV核酸疫苗

3.1.3 NDV Ⅳ系弱毒苗

3.1.4主要试剂

3.1.5 ELISA常用试剂

3.2方法

3.2.1免疫方法

3.2.2抗体检测

3.2.3 MTT法检测淋巴细胞增殖功能

3.2.4攻毒保护试验

3.2.5数据分析

3.3结果与分析

3.3.1间接ELISA法检测NDV抗体最佳工作浓度的确定结果

3.3.2 NDV核酸疫苗在小鼠体内诱导抗体的检测结果

3.3.3 NDV核酸疫苗在雏鸡体内诱导抗体的检测结果

3.3.4 MTT比色法检测小鼠淋巴细胞刺激指数结果

3.3.5 MTT比色法检测鸡淋巴细胞刺激指数结果

3.3.6母源抗体检测结果

3.3.7攻毒保护试验结果

3.4讨论

结论

参考文献

就读硕士期间发表的主要论文

致谢