四种马铃薯Y病毒属病毒的分子变异及HC-Pro结构对抑制RNA沉默的影响

摘要

马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein bandingmosaic virus，TVBMV)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)和小西葫芦黄花叶炳毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)分刖足危害茄科作物、十字花科蔬菜和葫芦科作物的主要病毒。本研究分析了这4种马铃薯Y病毒属病毒的分子变异以及蚜传辅助成分-蛋白酶(helper component proteinase，HC．Pro)部分结构变化对抑制RNA沉默功能的影响。 马铃薯Y病毒(PVY)： 1.本研究测定了山东省、河南省、安徽省、甘肃省和黑龙江省等地烟草和马铃薯上44个PVY分离物3'-端基因组(包括部分NIb、完整CP和3'-UTR)片段，以及其中25个分离物的H(-Pro基因并测定其序列。首次根据HC-Pro和CP编码区序列分析了中国烟草上PVY的遗传进化和分子变异情况。结果表明，中国烟草上PVY种群具有很高的遗传多样性，除了PVY<'N>和PVY<'o>外，还发现PVY<'N：o>和PVY<'NTN>株系在我国烟草上发生，而且PVY<'N:o>是最流行的株系。 2．遗传多样性分析证明，PVYCP编码区在其进化过程中处于正向或多样化选择，而HC-Pro编码区处于负向或纯化选择。进一步分析显示，寄主适应性和地理来源在PVYCP编码区进化过程中起作用。 芜菁花叶病毒(TuMV)： 1．利用生物学、血清学和分子生物学手段首次证明潍县萝卜红心病的病原是TuMV，并对其病害循环进行了研究。在此基础上，克隆了其CP基因，并构建了其表达载体，使其在大肠杆菌中得到了正确表达，为制备特异性抗血清奠定了基础。 2.本研究测定了2004-2007 4年间中国十字花科蔬菜上44个TuMV分离物3'-端基因组(包括部分NIb、完整CP和3'-UTR)序列，与GenBank上有明确寄主的74个TuMV中国分离物及100个东亚分离物的CP基因及3'-UTR序列比较，并对其遗传进化及分子变异情况进行了分析。结果表明，本研究得到的44个分离物3，端基因组片段大小为1125 bp或1126 bp，均包括48 bp的NIb基因序列、867 bp的CP基因序列、210 bp或211 bp的3'-UTR。这44个分离物在系统进化树上属于3个组，分别对应basal．BR、Asian-BR和world-B。首次发现中国basal-BR分离物的存在，并且发现了14个中国分离物属于basal-BR种群。 3．重组分析结果，WFLB-04、BJ1-06、BJ2-06 3个分离物CP基因及3'-UTR可能发生了重组。 4．分析了东亚144个分离物TuMV CP基因序列的遗传多样性，表明CP编码区在进化过程中氨基酸非常保守，处于负向或纯化选择压力，寄主选择性、地理来源等因素对其遗传多样性影响较小。 烟草脉带花叶病毒(TVBMV)： 1．TVBMV在中国烟草上的发生呈上升趋势，现已成为烟草生产上一种主要病毒，逐渐受到人们的重视。本研究测定了山东、河南、安徽、云南等地烟草上12个TVBMV分离物的3’-端基因组片段(包括部分NIb、完整CP和3'-UTR)，与GenBank上仅有4个分离物的基因组部分序列进行比较发现，这些分离物表现出一定的地理相关性。YN9和YND两分离物NIb和CP的切割位点为Q/N，其它分离物均为Q/G(马铃薯Y病毒属病毒普遍存在)。 2．本研究构建了YND分离物CP基因的原核表达载体，使其在大肠杆菌中得到了高效表达，并制备了相应的特异性抗血清，为在生产上快速检测TVBMV奠定了基础。 小西葫芦花叶病毒(ZYMV)： 1．采用RF-PCR的方法，对采自山东聊城的一表现严重花叶、黄化、蕨叶及果实畸形的南瓜样品进行了检测，同时扩增到了ZYMV、WMV、FMV和CMV 4种病毒的基因组片段，说明该样品受到这4种病毒的复合侵染。 2．根据CP基因核苷酸序列构建的系统进化树显示：42个zYMV分离物可划分为6个基因型，本研究得到的分离物与Con、Cal、Flo等11个分离物属于基因型Ⅲ。ZYMV中国分离物的变异性最大，不同地区的ZYMV分离物表现出一定的地域相关性。HC-Pro结构与功能的关系： 为明确HC-Pro参与蚜传和协生的基序对抑制RNA沉默是否有影响，针对参与蚜虫传毒和协生的基序设计一系列引物，获得了3个HC-Pro的突变体，通过农杆菌共浸润法，根据报告基因GFP的表达情况分析了不同突变体对抑制。RNA沉默的影响。结果表明，Phe<'7>、Asn<'12>的缺失及同时将lle<'250>和Gly<'251>分别突变为Asp和Glu得到的相应突变体均使HC-Pro丧失对RNA沉默的抑制活性，说明这3个位点参与HC-Pro抑制RNA沉默功能。

目录

论文说明：缩略词表

声明

第一章前言

一、马铃薯Y病毒属病毒的研究综述

1.马铃薯Y病毒属的生物学特性

2.马铃薯Y病毒属的分子生物学特性

3.马铃薯Y病毒属病毒的分类现状

二、植物病毒的分子变异

1.植物病毒变异机制

2.植物RNA病毒变异特征

三、本研究的目的和意义

第二章马铃薯Y病毒的分子变异

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1 PVY的提纯

2.2抗血清制备

2.3病毒样品的血清学检测

2.4 RT-PCR扩增

2.5 PCR产物的克隆

2.6序列分析

2.7 29个PVY分离物分子变异

2.8 15个PVY分离物分子变异

3. 结论和讨论

第三章芜菁花叶病毒的分子变异

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1 TuMV的提纯

2.2抗血清制备

2.3潍县萝卜红心病病原鉴定

2.4潍县萝卜TuMV分离物CP基因的克隆与原核表达

2.5十字花科蔬菜TuMV分子变异

2.6 8个TuMV分离物的3'-端基因组片段序列分析

2.7 44个TuMV分离物的3'-端基因组片段序列分析

3.结论与讨论

第四章烟草脉带花叶病毒的分子变异

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果分析

2.1 RT-PCR扩增

2.2 PCR产物的克隆

2.3序列分析

2.4 TVBMV CP基因的原核表达及抗血清制备

3.结论与讨论

第五章小西葫芦黄花叶病毒的分子生物学特性

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1 RT-PCR扩增及克隆

2.2序列测定及分析

2.3 ZYMV-LC 3'-端序列分析

2.4 TMV-LC CP序列分析

2.5 WMV-LC 3'-端序列分析

2.6 CMV-LC CP序列分析

3结论与讨论

第六章HC-Pro结构变化对抑制RNA沉默功能的影响

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果分析

3.结论与讨论

结论

参考文献

致谢

攻读博士期间发表论文