嗜热毛壳菌热稳定蛋白酶的纯化、基因克隆与表达

摘要

蛋白水解酶催化蛋白质中肽链的裂解，是一类在生理学和商业领域中具有广泛应用价值的酶。蛋白酶执行大量的不同的生理功能，负责包括在正常和非正常状态下复杂的病理、生理功能。它们也存在于致病生物体的生活史中，这就使它们成为一个潜在的发展治疗因子的对象，来治愈如癌症和艾滋病等可怕疾病。蛋白酶在食品和清洁剂工业中的应用具有悠久的历史。微生物来源的蛋白酶，由于具有培养简便，产量丰富等特点，适于工业化生产而得以广泛应用。其中，热稳定性蛋白酶的研究和开发具有重要的商业价值。 嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)是一种广泛分布的，生长上限温度较高的嗜热真菌，从该菌中已分离了多种嗜热酶，但未见该菌嗜热蛋白酶的报道。本研究中C.thermophilum在以酪蛋白为唯一碳源的合成培养基中诱导产生了蛋白酶，通过硫酸铵沉淀、DEAE-Seplaarose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了两种凝胶电泳均一的蛋白酶。SDS-PAGE测得所分离纯化酶蛋白的分子量分别约为33kD和63kDa。两种酶都可以被PMSF所抑制，但不能被iodoacetamide和EDTA抑制。PR033和PR063的最适反应pH分别为10.0和5.0。两种酶的最适反应温度均为65℃，在60℃以下较稳定，Ca<'2+>对酶的的热稳定性具有显著的增强作用。 根据真菌热稳定蛋白酶的同源保守序列设计兼并引物，通过RT-PCR及快速扩增cDNA末端(RACE)的方法，克隆了该蛋白酶的编码基因pro，全长cDNA为2007bp，包含一个由532个氨基酸组成的开放阅读框。该基因已在Genbank中注册，登录号为DQ839520，DNA序列的登陆号为EF100880。 由核苷酸序列推导的相应氨基酸序列前15个氨基酸为信号肽序列，比较蛋白酶的催化区序列，发现与丝氨酸蛋白酶S8家族的枯草杆菌蛋白酶subtilisin的同源性很高，在催化区中有两个基序GHGTHV和GTSMASPH非常保守。这些保守基序与丝氨酸蛋白酶家族催化活性有关。 将经EcoR I和Not I双酶切的pro基因和原核表达载体pET_22b(+)进行连接，构建成原核表达载体pET/pro，并转化大肠杆菌E. coli BL21。经IPTG诱导培养4～5h，目的蛋白得到大量表达,SDS-PAGE电泳检测，在约41kDa处有一条明显的蛋白带，蛋白大小与从该蛋白酶氮基酸序列估汁的蛋白分子量相符;而空质粒pET-22b(+)转化BL21经诱导培养后无相应蛋白产生。可溶性分析结果显示，表达的蛋白以包涵体形式存在。 pro基因和酵母分泌型表达载体pPIC9K双酶切后体外连接，构建酵母重组表达载体pPIC9K/pro并测序，保证正确的阅读框。将重组表达质粒pPIC9K/pro和pPIC9K空质粒分别用限制性内切酶Sac I(位于5’AOX1区内)线性化后，采用电击法转化pichiapastoris GSll5酵母感受态细胞，于MD/MM平板上筛选His<'+>Mut<'+>表型的酵母转化子。经过PCR检测及G418抗性筛选多拷贝整合子，进行甲醇诱导培养。通过检测各转化子每隔24h的蛋白表达情况来筛选高效表达目的蛋白酶的工程菌株。筛选到表达酶活性最高的菌株GS-PRO-16，甲醇诱导6d酶活性达到最高，达16.73 U/mL，酶蛋白表达量为0.77 mg/mL。检测目的蛋白的表达量及遗传稳定性，并测定表达蛋白酶的酶学性质。 酵母工程菌株GS-PRO-16在YPD平板上划线，连续传代10次后，PCR检测呈阳性，重组蛋白酶的表达量基本保持稳定。表达蛋白酶PRO的最适反应温度和pH分别为60℃和8.0，该酶在60℃以下稳定；70℃的半衰期为60min；在pH值为5.0～12.0之间表达蛋白酶保持稳定的酶活性。 C．thermophilum蛋白酶能在毕赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白，而且表达产物同样具有原始菌株C. thermophilum蛋白酶的优良特性，这就预示了表达蛋白酶在工业和生物学领域的广阔应用前景。因此，期望能对该基因进行改造，或进一步优化表达条件，获得真正有工业应用价值的酵母工程菌株。

目录

论文说明；英文缩略词及中文对照表

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第一章文献综述

第二章嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)热稳定蛋白酶的纯化及特性

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1不同培养时间对蛋白酶活性的影响

2.2酶的分离纯化

2.3蛋白酶的特性研究

3讨论

3.1 Chaetomium thermophilum蛋白酶的纯化

3.2 Chaetomium thermophilum蛋白酶的纯化时的样品处理

3.3 Chaetomium thermophilum蛋白酶的特性分析

3.4 Chaetomium thermophilum蛋白酶的应用潜力和存在的问题

第三章嗜热毛壳菌热稳定性蛋白酶基因的cDNA克隆及其序列分析

1材料和方法

1.1材料

1.2目的基因cDNA中间片段的分离

1.3嗜热毛壳菌丝氨酸蛋白酶基因组DNA的克隆

2.结果与分析

2.1蛋白酶cDNA基因的分离

2.2 Chaetomium thermophilum蛋白酶基因组DNA的扩增

2.3蛋白酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

2.4 Thermomyces lanuginosus丝氨酸蛋白酶基因片段的克隆及序列分析

3讨论

3.1用PCR及RACE技术分离基因

3.2蛋白酶基因PRO结构

第四章Chaetomiumthermophilum热稳定蛋白酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达

1.材料和方法

1.1材料

1.2试验方法

2结果与分析

2.1蛋白酶PRO成熟肽基因序列的限制性酶切位点分析结果

2.2蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达

2.3蛋白酶基因PRO在毕赤酵母中的表达

3讨论

3.1表达系统的选择

3.2利用限制性内切酶酶切外源基因、载体，构建表达载体时需要注意的问题

3.3线性化的原因及不同线性化方式的影响

3.4表达工程菌的培养条件

第五章结论和建议

1结论

2建议

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况