脂肪间充质干细胞复合纤维蛋白胶立体培养的实验研究

摘要

文章从以下两部分就脂肪间充质干细胞复合纤维蛋白胶立体培养的实验研究进行了综述。
　　第一部分成年兔脂肪间充质干细胞分离、培养、鉴定及成软骨诱导
　　目的：研究脂肪间充质干细胞体外培养生物学特性。建立其分离和培养的方法并探讨其向软骨细胞诱导分化的能力。
　　方法：成年新西兰大白兔取腹股沟及颈部脂肪，胶原酶消化分离。用含9-10％胎牛血清的高糖DMEM培养基培养传代。在倒置显微镜下观察细胞增长的形态。对3.7代细胞行MTT测定其增值能力。对3代细胞行软骨诱导分化。观察倒置显微镜观察下细胞的增长情况。诱导分化1周后进行细胞番红0染色，RT-PCR测定软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达。
　　结果：原代脂肪间充质干细胞培养2天后开始贴壁生长，呈现梭形及多角细胞生长，7-9天后细胞几乎融合呈旋涡状排列。培养的脂肪间充质干细胞体外增值较快，增长比较稳定。成软骨诱导后2一3天细胞发生聚集。对高密度细胞团块番红O染色阳性，未发生聚集的细胞则呈弱阳性或阴性。RT-PCR测定显示细胞表达11型胶原mRNA。
　　结论：本实验通过对兔脂肪组织基质来源的细胞进行分离、培养。根据红细胞生长方式是悬浮生长，通过自然纯化的方法去除培养过程中的红细胞和杂质，获得了增值迅速，长期传代后仍具有稳定增值的细胞。三向诱导实验证明细胞具有分化的潜能。ADSCs可以作为组织工程的种子细胞。
　　第二部分不同密度脂肪间充质干细胞复合纤维蛋白胶对成软骨能力的影响
　　目的：研究不同种植密度的兔脂肪脂肪间充质干细胞复合纤维蛋白胶体外三维立体培养下，细胞成软骨分化的能力。
　　方法：取3代培养兔脂肪间充质干细胞分别以2×109L-1，2×1010L-1，2×1011L-1，种植于含纤维蛋白胶的96孔板中，倒置显微镜及扫描电镜观察。成软骨诱导培养3周后，取样、切片行苏木精-伊红染色、胶原免疫组化，RT-PCR检测。
　　结果：诱导三周后各组细胞在纤维蛋白胶上黏附较好，且高密度2×1011L-1，组细胞排列紧密，基质形成较多，扫描电镜下高密度组纤维蛋白内细胞粘附生长较多，各组Ⅱ型胶原阳性，随种植密度的升高有逐渐递增的趋势。RT-PCR检测结果显示，随细胞种植密度升高，Ⅱ型胶原 mRNA、蛋白聚糖表达均增强。
　　结论：ASDCs通过内部植入可以是细胞在蛋白胶内均匀的增长，以2×1011L-1种植密度复合纤维蛋白胶有利ASDCs向软骨细胞分化。

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前 言

第一部分 成年兔脂肪间充质干细胞分离、培养、鉴定及成软骨诱导

材料与方法

1 主要仪器

2 主要试剂

3 实验动物

结 果

1 原代ADSCs的生长形态

2 ASDCs传代和扩增

3 ASDCs 的生长曲线

4 ASDCs诱导分化

5 番红O染色

6 Ⅱ型胶原的RT-PCR测定

材料与方法

1 主要仪器

2 主要试剂

3 实验动物

4 实验方法

结 果

1 显微镜观察

2 生长曲线

3 组织学、免疫组化检测

4 扫描电镜

讨论

结论

附图

附表

参考文献

综 述纤维蛋白胶在组织工程中的应用

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文