源自SPF鸡群内源性ALV/SD0501全基因序列鉴定分析及感染性分子克隆pSD0501的构建

摘要

禽白血病(AvianLeukosis，AL)是由禽白血病病毒(AvianLeukosisVirus，ALV)引起的以禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为主的各种肿瘤性传染性疾病，其中以禽淋巴细胞性白血病和肉鸡的髓细胞性白血病较为常见。目前，已有A～J10个亚群的ALV得到了分离鉴定。分离自鸡的ALV属于A、B、C、D、E和J亚群。E亚群ALV属于内源性ALV，另外内源性病毒样成分还包括内源性病毒(ev)位点、中等重复序列EAV(endogenousavianvirus)、来自鸡基因组的禽反转录转座子ART-CH(avianretrotransposonfromthechickengenome)以及高度重复序列CR1(Chickenrepeat1)。鸡体内的内源性反转录病毒样成分是真核生物中存在大量反转录成分的典型例子，通常认为E亚群ALV代表来自细胞内可移动的遗传成分(转座子)的反转录病毒的进化阶段，而其他成分则被认为是外源性反转录病毒退化的前病毒体，由于突变而失去了产生感染性病毒的能力。这些成分存在的实际意义是目前很多研究的主题。 ALV对人类健康可能存在潜在的威胁。近年来，ALV与其他免疫抑制性病毒混合感染日趋严重，致使鸡群的免疫抑制以及肿瘤发生率逐年增高，由于ALV在普通鸡群中广泛存在，所造成的免疫抑制给养鸡业带来的损失不可估量。且禽白血病直接影响蛋(胚)源或鸡源细胞的医学研究和生物制品的发展。因此，控制和消灭该病是一项重要而紧迫的任务。 本研究参照禽内源性白血病病毒相关序列，设计合成了四对检测引物，用以从SPF鸡群中检测禽内源性白血病病毒基因片段。将收集的不同批次不同场家的SPF鸡胚孵化至9-11日龄，常规制备CEF，提取细胞DNA，作为PCR扩增模板。PCR检测结果用Dot-blot进行验，结果显示PCR扩增均为特异性扩增。从SPF鸡群的不同片段阳性率统计结果看，内源性白血病病毒的整体携带率较高(gag，29/46；pol，27/46；env，24/46；LTR，31/46)，其中以LTR片段的携带率最高，并且不同鸡场差异性较大。 参照已发表的内源性ALV序列，设计合成了8对引物，选取四片段检测均为阳性的样品之一，经PCR成功扩增出了8段连续的、相互部分重叠的目的DNA片段，分别连接入T载体进行克隆测序。用DNAstar软件对测序结果进行拼接，从一个鸡胚得到了内源性白血病病毒ALN/SD0501前病毒全基因组序列。比较分析发现，该序列env基因与已知的E亚群内源性病毒代表株env基因的核苷酸序列同源性在98.5％以上，全基因组序列同源性在99.1％以上，而与其他亚群代表株同源性相对较低，env基因同源性仅为56.3％～91.5％。 以测序完成的ALV/SD0501株env基因序列为模板，设计引物进行PCR扩增，酶切，连入pGEX-6P-1载体，转化BL21菌株，初步鉴定后，经测序验证无误，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表明目的基因得到了比较高效的表达，切胶回收原核表达目的蛋白，免疫小鼠，制备抗血清。为今后更加深入的研究工作奠定了必要的基础。 以测序完成的内源性ALV/SD0501株全基因组cDNA为模版，采用PCR方法分5段扩增出ALN/SD0501株的前病毒基因组，PCR产物顺次连入质粒载体pUC19，获得一个含有完整ALV/SD0501前病毒基因组的重组质粒，命名为ALV/pSD0501，质粒纯化后转染CEF，IFA检测表明CEF中有针对ALV/SD0501env基因的蛋白表达，证明获得了具有感染性的克隆化病毒。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号及缩略词

声明

引言

1病原学

1.1病毒的分类

1.2病毒的基因组与结构

1.3内源性禽白血病病毒

1.4抗原性

1.5ALV的细胞嗜性

2.流行病学

3 病理学

3.1病原与发病机理

3.2眼观病理变化

3.3组织学变化

4.诊断及检测方法

5 ALV的控制

实验一 SPF鸡群中内源性白血病病毒分子流行病学调查

引言

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1PCR检测结果

2.2核苷酸序列测定结果

2.3Dot-blot结果

2.4数据分析

3.讨论

实验二SPF鸡胚中内源性ALV全基因序列测定与分析

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1PCR扩增结果

2.2检出的内源性白血病病毒的基因组核苷酸序列

2.3SD0501株cDNA全基因组与相关基因组结构的比较

2.4SD0501株cDNA全基因组序列与已知相关毒株序列的同源性比较

3 讨论

实验三 ALV/SD0501株env基因部分片段的原核表达及抗血清的制备

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果

2.1重组表达质粒的构建

2.2重组蛋白的表达

3讨论

实验四内源性ALN/SD0501株感染性分子克隆的构建

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果

2.1质粒pSD0501的鉴定

2.2重组质粒感染性的鉴定

3.讨论

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文情况

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致谢