狐源CDV H、F、N基因序列分析及其TaqMan荧光定量RT-PCR诊断方法的建立

摘要

为进一步研究犬瘟热病毒的防控与诊断，本研究采用分子生物学技术，分别设计合成了扩增CDVH基因、F基因和N基因的三对引物。采用RT-PCR分别扩增了狐源CDV泰安株(CDV-FOX-TA)的H基因、F基因和N基因，并将其分别克隆进pMD18-T载体，进行序列测定与分析。此外本研究还设计合成了一对特异性引物与TaqMan探针，对反应体系与条件进行优化，建立一种TaqMan荧光定量RT-PCR检测CDV的方法，试验结果表明： 1.CDV-FOX-TAH基因含有1个ORF，全长1824bp，共编码607个氨基酸，与CDV-A75/17株和部分野毒株编码的氨基酸数量相同，与CDV-Onderstpoort编码的604个氨基酸不同。CDV-FOX-TAH基因终止密码子不是AUU而是UGA。其上存在8个潜在的天冬酰氨糖基化位点，与野毒株和疫苗株均不同，与CDV-Onderstlooort、CDV-Convac、CDV-A75/17、CDV-LP的同源性分别为89.2％、90.6％、98.6％和98.7％。 2.CDV-FOX-TA的F基因含有1个ORF，全长1889bp，共编码662个氨基酸。有4个翻译起始密码子，其中3个位于阅读框内，1个位于阅读框外，CDV-FOX-TAF基因翻译起始密码子不是第1个或第2框内ATG，因其461-463位置不是ATG而是AUA，而是可能利用与CDV-A75/17相同的第二个起始密码子，因为CDV-FOX-TA这一区域的核苷酸与CDV-A75/17是完全保守的。CDV各毒株的F基因存在较大的差异，信号肽区域变异很大，但是F0蛋白裂解点(RRQRR)、13个半胱氨酸残基、4个潜在的天冬氨酰糖基化位点和2个疏水区都高度保守。 3.CDV-FOX-TAN基因含有1个ORF，全长1572bp，共编码523个氨基酸，编码的氨基酸序列可以分为三个区：N端可变区、C端可变区和中间高度保守区。CDV-FOX-TAN基因与CDV-Onderstepoort、CDV-Convac的N基因的同源性分别为96.0％和95.9％，与野毒的同源性介于98.4％-98.9％之间。CDV-FOX-TA与弱毒的差异主要表现在C端和N端，中间区域高度保守。 4.建立的CDVTaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，具有高度特异性、敏感性、良好的可重复性和稳定性、而且简便、快速。

目录

文摘

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声明

引言

1犬瘟热研究进展

1.1病原

1.2致病机理

1.3流行病学

1.4临床症状

1.5病理变化

1.6诊断学

1.7防治

2犬瘟热病毒分子生物学特征

2.1形态学和基因特征

2.2病毒蛋白

2.3 抗原变异性

3实时荧光定量PCR研究进展

3.1实时定量PCR原理

3.2实时荧光定量PCR分类

3.3实时荧光定量PCR的特点及优点

3.4实时荧光定量PCR的应用

3.5在兽医学研究领域的应用

3.6实时荧光定量PCR的展望

实验一CDV-FOX-TA H、F和N基因的克隆与序列分析

1材料与方法

1.1病毒

1.2主要试剂与仪器

1.3引物的设计与合成

1.4常规DNA操作技术

1.5病毒总RNA的提取

1.6 RT-PCR

1.7 H、F和N基因的克隆与序列分析

2结果

2.1 RT-PCR扩增结果

2.2 CDV-FOX-TA H、F和N基因重组质粒的鉴定

2.3同源性分析及系统发生树的构建

3讨论

实验二TaqMan荧光定量RT-PCR检测CDV方法的建立与初步应用

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2 结果

2.1反转录反应条件的优化结果

2.2 RT-PCR反应体系与反应条件筛选结果

2.3 TaqMan荧光定量RT-PCR反应体系及反应条件筛选结果

2.4特异性试验结果

2.5敏感性试验结果

2.6重复性试验结果与标准曲线

2.7CDV TaqMan荧光定量RT-PCR方法的初步应用结果

3讨论

结论

参考文献

致谢

个人简历、攻读学位期间发表部分论文情况

附录