诱导多功能干细胞(iPS)对小鼠下肢缺血再灌注损伤的保护作用研究

摘要

诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）是一种新型干细胞，系经转入4个特定的转录因子(Oct3/4，Sox2，Klf4、c-Myc)到小鼠或人的体细胞，诱导其重编程为未分化的多能细胞。它可分化成内皮细胞、平滑肌细胞和外膜细胞，通过移植hiPSCs衍生的这些细胞可以促进血管和肌肉的再生。针对局部缺血损伤，iPS细胞发挥其作用依赖于其定向富集于损伤部位。
　　目的：本工作拟在iPS细胞，研究miNA对iPS细胞的迁移、黏附影响；建立小鼠急性下肢缺血再灌注损伤缺血模型，观察iPS细胞是否对下肢缺血再灌注损伤有保护作用。
　　方法：我们在成功制备出诱导多功能干细胞的前提下进行研究。首先体外研究：向iPS细胞转染consiRNA和miRNA217观察转染后的iPS细胞迁移粘附的情况。体外：以C57BL/6J，8-10周龄雄性小鼠，制作小鼠下肢缺血再灌注损伤模型，右下肢作为对照组，分别在术后当天和第二天从尾静脉注射pbs、ips、mef（胚胎成纤维细胞）、controlsiRNA+ips、miRNA-217+ips6?104个/只/次/200ul.。细胞事先用红色荧光染料处理，观察72h后取材。
　　结果：⑴参照Yamanaka方法成功制备出诱导性多功能干细胞。⑵给予miRNA-217刺激iPS细胞后，对 iPS细胞的迁移能力无明显影响。⑶在急性小鼠缺血再灌注损伤模型，观察到ips形态呈梭形,ips细胞可以归巢到缺血/再灌注损伤的股动脉血管内膜。⑷缺血再灌注损伤小鼠尾静脉注射 ips细胞或 MEF后28天，小鼠组织器官均无肉眼可见的肿瘤发生。⑸尾静脉注射iPS细胞组较PBS和MEF组下肢缺血损伤侧肢体的血流灌注明显改善（*P<0.05），而经Lipo2000和miRNA-217预处理的 iPS组较单独注射iPSCs组的治疗效果明显下降（*P<0.05）。⑹在损伤的后肢组织HE染色显示：iPS细胞组肌细胞核数量明显多于MEF、PBS、con-siRNA+iPS和mirRNA-217组，后4组的细胞数量、形态无明显差异（n=9）。⑺DiI(呈红色荧光)标记的 iPS细胞的定位显示，iPS组较consiRNA+iPS组和miRNA-217+iPS2组小鼠损伤组织中阳性细胞数明显多（P<0.05）。⑻CD31免疫荧光化学方法检后肢缺血再灌注损伤部位小鼠肌肉组织血管的改变情况：阳性计数在PBS、MEF、iPS、con-siRNA+iPS、miRNA217+iPS5组间比较无统计学差异。⑼实时PCR检测显示：注射iPS和con-siRNA-iPS组在各个基因中的变化趋势一致。在iPS、con-siRNA-iPS、miR-217-iPS3个组的IL-1βmRNA表达水平比PBS(1±0.24)和MEF(0.86±0.4)明显升高，有统计学差异。IL-2mRNA在iPS组的表达明显高于其余4组。TNF-α和MCP-1基因在iPS组表达水平最低，与其余4组比较均有统计学差异。IGF-1表达水平在 iPS、con-siRNA-iPS，miR-217-iPS3个组中的表达水平均较 PBS和MEF组高（P<0.05）。其余基因在各组之间比较无统计学差异。⑽Teto定量：IPS细胞组的总DNA中Teto含量最高，与PBS组和MEF组比，iPS细胞组和miRNA217+iPS细胞组有显著性差异（*P<0.05）；与其他细胞组相比，IPS细胞组 Teto含量明显多（*P<0.05）。
　　结论：iPS细胞可定向归巢到缺血/再灌注损伤部位，本实验剂量6104个/只/次/200ul下无成瘤性，但能减小炎症梗死面积并改善血流恢复和下肢功能，iPS细胞对后肢缺血再灌注损伤治疗中具有靶向治疗和保护作用。miRNA-217减轻iPS细胞的粘附，减弱iPS对后肢缺血再灌注损伤的的治疗作用。

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缩略语表

第一章、前 言

第二章 材料和方法

1. 主要仪器、材料和试剂

2.实验方法

第三章 实验结果

1.成功制备出诱导多动能干细胞

2. 体外转染miRNA-217对iPS细胞跨内皮细胞的粘附、迁移能力的影响

3.IPs在急性小鼠缺血再灌注损伤模型中的去向

4.缺血再灌注损伤小鼠尾静脉注射ips或MEF成瘤情况

5.尾静脉注射细胞后各组模型小鼠的肢体运动功能及血流情况

6. 3天后缺血再灌注部位组织的HE染色情况

7.红色荧光（DiI）处理的细胞进入急性缺血再灌注损伤的动物体内的定位

8.免疫荧光化学染色检测缺血再灌注损伤处边缘组织血管情况

9.实时PCR检测iPS和miRNA-217对下肢缺血再灌注损伤后肌组织炎症因子的表达

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

综述:诱导多功能干细胞的相关研究进展