黄瓜RubisCO活化酶基因（RCA）正义表达载体的构建及其遗传转化的研究

摘要

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RubisCO)是光合碳循环中的关键酶，其活性高低是与光合暗反应能力密切相关。所以，具有稳定的RubisCO活性可能是植物适应逆境的主要途径。RubisCO只有处于活化状态时才具备催化功能，钝化态的RubisCO必须经过RubisCO活化酶(RCA)的活化才能表现出其羧化/加氧活性，即RubisCO在植物体内的活性受RCA的调节和控制。因此，RCA对调控植物的光合作用，增强其对逆境的适应能力具有重要作用。本研究从黄瓜叶片中克隆到RubisCO舌化酶基因(RCA)，构建了其正义表达载体，用子房注射法导入黄瓜植株，同时研究了弱光、亚适温弱光和低温弱光下RubisCO大、小亚基及RubisCO活化酶基因的表达及其对光合作用的影响。主要结果如下： 1.根据GenBank中印度黄瓜的RubisCO大、小亚基基因(rbcL、rbcS)序列设计特异引物，通过RT-PCR的方法从黄瓜叶片中克隆得到549 bp的大亚基和490 bp的小亚基基因片段，并在GenBank上注册(rbcL：EF208123，rbcS：EF208124)。 2.根据GenBank中黄瓜的RCA序列设计特异引物，通过RT-PCR的方法从黄瓜叶片中扩增到基因全长cDNA。将其在GenBank注册，注册号为EFEF421974。 3.将RCA基因的cDNA正向插入植物双元表达载体pCAMBIA1301的强启动子CaMV35S与终止子Tnos之间，成功构建RCA正义表达载体，命名为pCAMBIA1301-RCA。农杆菌介导法转化烟草，子房注射法转化黄瓜，获得了转正义基因的烟草和黄瓜植株。 4.用实时荧光定量PCR法对弱光、亚适温弱光、低温弱光处理和对照(CK)黄瓜幼苗的rbcL、rbcS、RCA基因进行定量分析，结果表明，弱光和亚适温弱光处理的，rbcL、rbcS和RCA相对表达量均明显降低，但5～7d后或趋于平稳，或缓慢回升；而低温弱光处理的rbcL、rbcS和RCA相对表达量呈直线下降，胁迫5d时rbcL和RCA的表达量接近零，rbcS较处理前降低63.9％。 5.弱光、亚适温弱光和低温弱光处理的Pn变化趋势与rbcL、rbcS、RCA的相对表达量基本相似，表明弱光、亚适温弱光和低温弱光下rbcL、rbcS、RCA相对表达量降低是黄瓜幼苗光合速率降低的重要原因。

目录

论文说明：英文缩写符号及中英文对照表

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摘要

1 引言

1.1 RubisCO与植物的光合作用研究进展

1.1.1 RubisCO的基本性质

1.1.2结构与组装

1.1.3活性调节及其活化机制

1.1.4基因工程

1.2 RCA与植物光合作用研究进展

1.2.1 RCA的分子特性

1.2.2 RCA对RubisCO的活化

1.2.3环境因子对RCA的影响

1.2.4 RCA基因工程

1.3本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株与质粒

2.1.3酶及生化试剂

2.1.4 PCR引物

2.1.5烟草培养基及配方：

2.2试验方法

2.2.1黄瓜rbcL、rbeS片段和RCA基因全长序列的获得

2.2.2黄瓜RCA基因正义表达载体的构建

2.2.3根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备与转化

2.2.4子房注射法转化黄瓜

2.2.5低温弱光下rbcL、rbcS和RCA基因表达及其对光合速率的影响

3.结果与分析

3.1黄瓜rbcL、rbcS及RCA基因的克隆

3.1.1 rbcL与rbcS片段的克隆

3.1.2.RCA基因的克隆

3.1.3 RCA核苷酸及氨基酸序列

3.1.4黄瓜RCA基因的核苷酸与氨基酸序列同源性分析

3.2黄瓜RCA基因正义表达载体的构建

3.2.1正义表达载体的构建

3.2.2正义植物表达载体的鉴定

3.3 RCA基因转化烟草

3.4 RCA基因转化黄瓜及转基因植株的分子检测

3.5低温弱光下黄瓜幼苗rbcL、rbcS及RCA基因的表达

3.5.1目的基因与内参基因扩增效率一致性的检测

3.5.2融解曲线分析

3.5.3 rbcL和rbcS基因表达

3.5.4 RCA基因表达

3.5.5低温弱光下黄瓜幼苗光合速率

4.讨论

4.1 RCA提取过程中的问题及对策

4.2 RCA基因全长的获得

4.3正义表达载体的构建

4.4关于烟草组培过程中的问题

4.5子房注射法获得转基因黄瓜

4.6实时荧光定量测定光合关键酶的表达

5结论

6下一步研究工作的设想

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文